TLR4基因单核苷酸多态性与军团菌感染的体外实验研究

TLR4基因单核苷酸多态性与军团菌感染的体外实验研究张帆;祁琨;姚红
【摘要】目的从体外实验探讨TLR4基因单核苷酸多态性TLR4 (2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)与军团菌感染的关系. 方法用军团菌刺激健康人(n=54)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),real-time RT-PCR检测PBMC中TLR4及MyD88的表达水平,ELISA法检测培养上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的水平,采用SNaPshot技术对TLR4多态性(2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)进行分型检测. 结果体外实验显示TLR4(2244G→A)AA 型TNF-α表达显著高于GG/GA型(P=0.0367),然而GG/GA型MyD88、IL-6的水平显著高于AA型(P=0.0352,P=0.031 7).但是TLR4(A2299 G)及
TLR4(T2242C)各种基因型之间TNF-α、IL-6、IL-1β及TLR4、MyD88的表达均无差异(P＞0.05). 结论 TLR4基因单核苷酸多态性与军团菌感染的宿主易感性可能无关.%Objective To explore the association between Toll-like receptor 4 single nucleotide polymorphism (SNP) 2244G→A,2299A→G,2242T→C and the susceptibility of Legionella infection in vitro experimental research.Methods The peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from healthy subjects (n =54) were stimulated with L.pneumophila.Real-time RT-PCR was used to detect the mRNA expression level of TLR4 and
MyD88.The levels of TNF-α,IL-1b and IL-6 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).TLR4 genotyping was performed with SNaPshot technology.Results In vitro assay results showed that the TNF-α expression was significantly higher in TLR4(G2244A) AA than in GG/GA(P =0.036 7).The mRNA expression of MyD88 and the level of IL-6 were
significantly lower in TLR4 (G2244A) AA than in GG/GA (P =0.035 2,0.031 7).Whereas the expression of TNF-α,IL-6,IL-1β,TLR4 and MyD88 showed no statistical difference among different genotypes of TLR4 A2299G and TLR4 T2242C polymorphism(P ＞ 0.05).Conclusion The findings indicate that there is no association about the TLR4 (2244G→A),(2299A→G),(2242T→C) polymorphism with susceptibility to L.pneumophila infection.
【期刊名称】《山西医科大学学报》
【年(卷),期】2017(048)010
【总页数】4页(P1030-1033)
【关键词】基因多态性;Toll样受体;军团菌;细胞因子
【作者】张帆;祁琨;姚红
【作者单位】山西医科大学微生物学与免疫学教研室,太原030001;山西医科大学第一医院老年病科;山西医科大学微生物学与免疫学教研室,太原030001
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是一类进化保守的胚系编码的模式识别受体(PRR),可以识别并结合不同的细菌或病毒的分子结构,启动机体的天然免疫反应。

国内外学者研究表明人TLR4基因(Asp299Gly和Thr399Ile)多态性可能与多种感染疾病易感性及发展和预后相关。

TLR4(Asp299Gly,Thr399Ile)基因的单核苷酸多态性与多种感染性疾
病包括脓毒症、肺炎球菌病、脑膜炎等关系密切[1-4];Hawn等[5]对荷兰一次暴发的军团菌病进行了研究,比较病例组与对照组TLR4等位基因频率和基因型频率,发
现TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile都与军团菌病的易感性有关,而且TLR4 896G
及1196T均为军团菌感染的保护性基因,拥有这2个SNP的个体能抵抗军团菌感染。

由于基因多态性在不同人群和地域的分布频率不同,TLR4编码区的
Asp299Gly(D299G)和Thr399 Ile(T399I)单核苷酸多态性位点在中国人群突变频
率比较低。

冯凯等[6]和王永堂[7]研究发现在我国汉族人群TLR4基因多态性有以
下3个位于5′调控区的新的高频分布SNP:即TLR4(2244G→A)、
TLR4(2299A→G)及TLR4(2242T→C)。

目前关于TLR4的这3个SNP基因多态
性与军团菌感染易感性尚未见研究。

本研究通过体外实验观察TLR4(2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)与军团菌感染的关系,分析TLR4不同基因型对髓样分化因子88(MyD88)mRNA,TLR4 mRNA和TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响，初步阐明我国汉族人群TLR4基因多态性与军团菌感染易感性的发生机制。

1.1 材料
由太原市红十字血液中心取健康人(n=54)外周血,采用密度梯度离心法分离外周血
单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);嗜肺军团菌血清1型(Legionella pneumophila subsp)ATCC 33152,购自美国标准菌种保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 试剂
军团菌BCYE培养基(英国OXIOD公司);人淋巴细胞分离液(美国sigma公司);改良型RPMI 1640培养基(美国Thermo公司);标准胎牛血清:杭州四季青生物工程材
料有限公司;RNAisoTM Plus总RNA提取试剂(TaKaRa D9108A宝生物大连有限公司);RT-PCR一步法试剂盒(TaKaRa DRRO86A宝生物大连有限公司);TNF-α、
IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(北京四正柏生物技术有限公司)。

1.3 军团菌刺激外周血PBMC
由太原市红十字血液中心取健康人40 ml外周血,分离PBMC前保留5 ml外周血,以备TLR4 SNP分型检测,用人淋巴细胞分离液分离血液中PBMC,台盼蓝染色计数活细胞数,以每孔2×106个细胞接种于24孔板用1640培养基在37 ℃,5%CO2条件下培养。

将军团菌与PBMC共同孵育(PBMC与军团菌比例为1 ∶10)2 h,待军团菌进入贴壁细胞后弃上清,用1 ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2次,然后继续培养24 h后收获细胞。

细胞培养上清液保存于-80 ℃,用于ELISA法检测细胞因子。

1.4 用real-time RT-PCR法检测细胞TLR4及MyD88表达水平
将收获的细胞按照RNAisoTMPlus试剂盒说明提取总RNA,TLR4,MyD88的RT-PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司设计合成,其序列见表1。

取2 μl RNA样本进行real time RT-PCR,反转录反应条件为42 ℃,5
min;95 ℃,10 s。

PCR反应条件为95 ℃,5 s;60 ℃,30 s;循环40次,所有循环结束后,绘制融解曲线判断扩增产物的特异性。

荧光信号由本底进入指数增长阶段达到荧光阈值所对应的循环数称为Ct值。

Ct值可以反映每个样品内表达量的多少,用CtmRNA/Ctβ-actin反映每个样品中mRNA的相对表达水平,此值越大,表示其mRNA表达越少。

1.5 ELISA法检测上清液细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α
军团菌刺激PBMC 24 h后培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度遵照ELISA 试剂盒的方法检测。

1.6 采用SNaPshot技术进行TLR4 SNP分型检测
SNaPshot技术是由美国应用生物公司(ABI)开发,基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序。

Toll样受体4(TLR4)有3个SNP位点,位于5′调控区的
AF177765(G2244A)和(A2299G)以及(C2242T,rs10116253)。

按照SNaPshot试剂盒方法进行TLR4 SNP分型,多态性位点引物序列见表2。

1.7 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件,基因型频率采用直接计数法,mRNA和细胞因子的水平用均数±标准差表示,不同TLR4多态性间各指标的差异采用秩和检验。

P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 TLR4 G2244A基因多态性与细胞因子及TLR4、MyD88的关系
TLR4 G2244A中GG,GA,AA三种基因型TNF-α、IL-6、IL-1β的表达差异无统计学意义(P>0.05);但是GG/GA与AA之间TNF-α、IL-6表达差异有统计学意义(P=0.036 7,P=0.031 7)。

TLR4 G2244A中GG,GA,AA三种基因型TLR4和MyD88的表达无差异(P>0.05);但是GG/GA与AA型之间MyD88的表达差异有统计学意义(P=0.035 2),GG/GA的表达明显高于AA(1.40±0.21 vs 1.58±0.25,见表3,4)。

2.2 TLR4 A2299G基因多态性与细胞因子及TLR2，4，MyD88的关系
TLR4 A2299G中AA,AG,GG三种基因型TNF-α、IL-6、IL-1β及TLR4、MyD88的表达均无差异(P>0.05);AA与GG/GA之间也无差异(P>0.05,见表5)。

2.3 TLR4 T2242C基因多态性与细胞因子及TLR2，4，MyD88的关系
TLR4 A2299G中三种基因型TT,CT,CC的TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR2、TLR4及MyD88表达无差异(P>0.05);TT与CT/CC之间也无差异(P>0.05,见表6)。

天然免疫受体TLR4识别配体之后主要通过衔接蛋白髓样分化因子88(MyD88)依赖性途径传递信号,继而产生炎症细胞因子如IL-1,IL-6,IL-8和TNF-α等的转录,激活天然免疫系统,杀伤入侵病原微生物。

由于TLR在天然免疫中的重要作用,这类基因的多态性可改变感染的宿主易感性,国内外学者研究表明人TLR4基因
(Asp299Gly和Thr399Ile)多态性可能与多种感染疾病易感性及发展和预后相关。

Michel等[8]发现,Asp299Gly和Thr399Ile单核苷酸多态性与机体对LPS低反应性有关。

研究表明TLR4基因多态性与军团菌肺炎可能有关,TLR4基因的单核苷酸多态性由于改变了受体结构域,可影响对病原体的识别,减弱或抑制LPS信号转导,从而导致机体对军团菌的天然免疫反应减弱。

TLR4编码区的Asp299Gly(D299G)和Thr399 Ile(T399I)这两个单核苷酸多态性与多种感染性疾病包括脓毒症、肺炎球菌病、念珠菌感染等的易感性及发展和预后相关。

但是TLR4 Asp299Gly和
Thr399Ile基因多态性在亚洲人群中极为少见,吕欣等[9]检测了健康汉族人群及缺血性卒中患者DNA样本,未发现Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性。

Hang等[10]也认为TLR4基因编码区Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性在中国人群中非常罕见。

冯凯等[6]发现在我国汉族人群TLR4基因多态性有2个位于5′调控区的新的高频分布SNP(即TLR4(2244G→A)、TLR4 (2299A→G)；王永堂[7]发现TLR4基因启动子区存在高频SNP(2242T→C),碱基变异频率为43.27%,2242
T→C碱基变异可增强TLR4基因启动子活性,有可能为功能性突变。

并且证明2242T→C碱基变异能显著增强个体对内毒素的反应性,进一步通过人群实验提示含TLR4基因5′启动子区2242 C等位基因的个体在严重创伤后发展成MODS及脓毒症的危险性相对较高,对脓毒症可能是一个易感因子。

那么TLR4(2244G→A)、(2299A→G)、(2242T→C)基因单核苷酸多态性与军团菌感染易感性的关系如何,TLR4基因多态性对信号转导通路中MyD88表达水平、细胞因子水平的影响如何,国内外还未见研究报道。

本研究通过体外实验探讨TLR4基因多态性与军团菌宿主易感性的分子机制，分析了军团菌刺激具有TLR4不同基因型的个体外周血PBMC后相应的信号通路分子MyD88及其相关细胞因子表达水平。

结果发现，与TLR4(G2244A)AA基因型相比,GG/GA型个体的PBMC受到军团菌刺激后表达较高水平的MyD88(P=0.035 2)和IL-6(P=0.031 7)以及较低水平的TNF-α(P=0.036 7),而IL-1β表达未见差别,故而TLR4 G2244A中AA与军团
菌感染易感性有待于增加样本量做进一步的研究;然而TLR4 A2299G及TLR4
T2242C个体的PBMC在受到军团菌刺激后MyD88 mRNA和TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平在各个基因型之间均无统计学差异(P>0.05)。

表明
TLR4(2299A→G)及TLR4(2242T→C)SNP与军团菌感染易感性无关。

军团菌病日益成为现代社会发展一个突出的公共卫生问题,军团菌病易感性的研究是发病机制和病因学研究的关键问题之一,本课题通过体外实验初步证实TLR4
G2244A、A2299G、T2242C基因多态性与军团菌感染易感性无关。

为探讨TLR4基因多态性对人类军团菌易感性的影响以及可能的机制提供线索,也为军团菌病的发病机制及制定和采取有针对性的防治措施提供新的思路和科学依据。

【相关文献】
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