20人参皂苷Rh2对人结直肠癌Caco2和HT29细胞增殖的影响

20(S)-人参皂苷 Rh2对人结直肠癌 Caco-2和 HT-29细胞增殖的影响
李秋影 1, 2，颜璐璐2，张莉华2，张兰兰2，马晓慧2，郭治昕 2 *
（1. 天津中医药大学，天津，300193 ；2.天津天士力研究院药理毒理所，天津，300410）摘要：目的本实验探讨 20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和 HT-29 细胞增殖及凋亡的影响。

方法采用荧光微孔法测定20(S)- 人参皂苷Rh2 对体外培养的人结直肠癌Caco-2、HT-29 细胞增殖的影响，并计算抑制率；利用显微镜观察给药后细胞形态变化。

结
果 20(S)-人参皂苷Rh2 对 Caco-2、 HT-29细胞生长有抑制作用，并呈剂量依赖性；20(S)-人参皂苷 Rh2 作用 48h 后 HT-29 、 Caco-2细胞达到半数抑制浓度（ IC50）为、·mL-1 ；显微镜显示 HT-29 细胞经 25ug/ml 20(S)-人参皂苷 Rh2 作用后细胞之间互相脱离，成多边形状，
细胞破碎。

结论20(S)-人参皂苷Rh2 可以抑制Caco-2 、HT-29 细胞生长并导致其凋亡。

关键词： 20(S)-人参皂苷Rh2； HT-29； Caco-2；细胞凋亡
Effect of 20(S)-ginsenoside Rh2 on the proliferation of human colon cancer cells Caco-2 and HT-29 LI Qiu-ying1, YAN Lu-lu2, ZHANG Li-hua2, ZHANG Lan-lan2, Ma Xiao-hui2, GUO
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193,China;
2： The Department of Pharmaclogy and Toxicology of Tasly ， Tianjin ， 300410）
Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of 20(s)-ginsenoside-Rh2 on the proliferation of human colon cancer cell lines Caco-2 and HT-29 。

METHODS Cellgrowth inhibition was evaluated by Cell based Fluorescent Staining Digital Image High Content Screening assay. Cellular morphology was observed under Microscopy.
RESULTS 20(s)-ginsenoside Rh2 inhibited the proliferation of Caco-2 、 HT-29 cells in a dose-dependent manner. The IC50 of 、·mL-1 were detected after Caco-2 、HT-29 cells treated with 20 (s)-ginsenoside-Rh2 for 48 hour; Microscopy showed obviously apoptosis morphologic changes of HT-29 and Caco-2 cells were treated with different 20(s)-ginsenoside-Rh2. CONCLUSION 20(s)-ginsenoside Rh2 exhibits the growth inhibition effects and induces apoptosis in the test concentration on human colon cancer Caco-2 and HT-29 cells.
Key words: 20(S)-ginsenoside Rh2; HT-29; Caco-2; Apoptosis
人参为五加科人参属植物人参（Panax ginseng . meyer）的干燥根，是已有近几千年应用历
史的名贵中药。

现代医学研究表明，人参包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性 [1-4] 。

人参皂苷作为人参中一类主要药效成分，在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性，其中以人参皂苷 R-Rg3 为主要成分的抗癌新药参—胶囊已作为中药一类新药上市 [5] 。

大量研究报道，人参皂苷 -Rh2 也同样具有较好的抗癌活性 [6-11], 如诱导黑色素瘤细胞分化、逆转
耐药的白血病细胞、通过细胞内 caspase 一类半胱氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人
黑色素肿瘤细胞A375-S2 细胞的增殖并产生凋亡；药代动力学表明人参皂甙-Rh2主要在肝、胃肠道分布 [12] 。

目前研究已表明人参皂苷 -Rh2 可以通过线粒体途径包括P53、CASP5等多靶点诱导结肠癌SW480 细胞凋亡 [13] 。

从结构上，人参皂甙-Rh2 可分为 S 型和 R 型的构象，其中 S-Rh2 是植物中分离的主要构
型[14] 。

S 型的人参皂甙 -Rh2（ 20(S)-G-Rh2 ）对人结直肠癌细胞的影响目前还未见报道。

本研究旨在观察20(S)-G-Rh2 对人结直肠癌 Caco-2 和 HT-29 细胞增殖和凋亡的影响，以期为其的新药研发和临床治疗结直肠癌提供理论依据。

1 材料与方法
试剂及仪器
20(S)-G-Rh2（纯度为 90%）由天津天士力药物研究院现代中药研究所提供；DMEM培养基
和胎牛血清购于GIBCO-BRL公司；CMSEE、二乙酸荧光素(Fluorescein Diacetate, FDA) 购
于 Sigma 公司； Caco-2、 HT-29 细胞从协和医科大学基础医学细胞中心引进，由本实验室传代
培养； Olympus 显微镜； Leica DMI6000 B 电动倒置荧光相差显微镜为莱卡公司产品。

细胞培养与传代
将 HT-29 和 Caco-2 细胞置于 37 ℃，饱和湿度 5%CO2 培养箱中常规培养，培养均用含 10% 热灭
活胎牛血清， 1%的抗生素（青霉素 100mg·L-1 和链霉素 100mg·L-1 ）的 DMEM 完全培养基。

细
胞呈单层生长，达 80% 左右融合时，采用 %的胰酶和 % EDTA （ 1： 1）混合消化液消化传代，取
生长对数期的细胞用于实验。

荧光微孔法监测细胞增殖实验
将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞，用 %的胰酶和 % EDTA 混合消化液消化，用含10%
胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 个·mL-1 。

接种于 96
孔培养板中，每孔接种100 μL，于 37℃，饱和湿度5%CO2 培养箱中培养24h 后换液，空
白对照组不加药，实验组每孔加入20(S)-G-Rh2 ，浓度依次为50，， 25，，，·mL-1处理48h，
每个浓度组及对照组均做 3 个平行孔。

吸弃板中培养基，加入100μL 含μg·mL-1 二乙酸荧
光素的 PBS，避光 15min ，甩去荧光染料，加入150μL过滤的PBS重复洗3遍，甩去PBS
并吸弃板中剩余的PBS，Leica DMI 6000 B 电动倒置荧光相差显微镜在激发和发射波长分
别为 488 nm 和 530 nm 下，测定每孔的荧光强度。

根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长
的抑制率，并求算出半数抑制浓度(IC50) 。

细胞生长抑制率%＝（ 1-给药组荧光强度/对照组荧光强度）×100％
显微镜观察细胞形态学变化
将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞，用 %的胰酶和 % EDTA 混合消化液消化，用含10%
胎牛血清的DMEM完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL ，每孔 2 ml 细
胞悬液种于 6 孔板中放置盖玻片，培养细胞爬片生长。

培养24 h，待细胞在盖玻片上贴壁
良好后，加入 1 ml 不同浓度20(S)-G-Rh2、、25μg·mL-1)处理细胞48h，在倒置显微镜下观
察细胞核形态变化并记录。

统计学处理
用软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差即 (x ±s)表示，组间分析比较采用 t 检验， P< 表
示差异有统计学意义。

2 结果
20(S)-G-Rh2 对 Caco-2 和 HT-29 细胞增殖的影响
FDA 可进入活细胞脱脂释放荧光素显荧光，激发和发射波长分别为488 nm 和 530 nm，常
用于检测细胞存活率。

本研究采用 FDA 为荧光指示剂建立了微孔板法进行20(S)-G-Rh2 对
结肠癌细胞 Caco-2 和 HT-29的增殖影响研究。

结果显示， 20(S)-G-Rh2对 Caco-2 和 HT-29
细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度而增强，呈现较好的剂量依赖性。

计
算药物对 HT-29 和 Caco-2 细胞细胞的半数抑制率(IC50) 分别为μg·m-1L 和μg·m -L1 （。

结
果如表 1，图 1）。

表 1 不同浓度 20(S)-G-Rh2 对 Caco-2、 HT-29 细胞的生长抑制率 (x ±s,n=3)
Growth suppression rate of Caco-2 after different concentration of 20(s)- G-Rh2(x s,n=3)
±Group 20(S)-G- Rh2/ μ g· m-1L
25 50 75
Caco-2±±±±±
HT-29±±±±±
P<, μ gｍ·L-1
(A) (B) (C) (D)
图 1 荧光微孔法监测细胞增殖。

A： HT-29 细胞组； B： HT-29 细胞 25ug/ml 20(S)-Rh2
给药组； C： Caco2 细胞组； D： Caco2 细胞 25ug/ml 20(S)-Rh2给药组。

显微镜观察细胞形态学变化
HT-29 细胞经 25μ g· mL120(S)--G-Rh2处理48小时后，与空白对照组比较，细形态变化不
明显。

25μg·mL-1 20(S)-G-Rh2处理48 h后的HT-29细胞较空白对照组细胞数目明显减少，
高倍显微镜下可见空白对照组的细胞成群贴壁生长，细胞透亮，折光性好，核圆而大，细胞
核形态正常，染色质分布均匀。

而给药组细胞之间互相脱离，与周围细胞脱离，成多边形状，
细胞破碎。

高剂量组处理的细胞
细胞轮廓消失，核崩解（见图2）。

(A) (B)
A ： HT-29细胞组；B： HT-29
图 2 20(S)-G-Rh2对HT-29细胞形态学的影响。

细胞 25ug/ml 20(S)-Rh2给药组。

3讨论
人参皂苷是人参的主要活性成分，在人参皂苷单体中人参皂苷-Rh2 具有抑瘤活性，并对正
常组织毒性甚低 [11] 。

体内外实验结果表明：通过对细胞周期的影响，诱导细胞凋亡，从而
时间和剂量依赖性地抑制多种肿瘤细胞的增殖[15-19] 。

但 20(S)-人参皂苷 Rh2 对人结直肠
癌细胞 Caco-2 和 HT-29 的研究还未见报道，因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2
和 HT-29 细胞，考察 20(S)-G-Rh2 对人结肠癌细胞的抑制及凋亡作用。

本研究结果表明， 20(S)-G-Rh2 可抑制人结直肠癌细胞 Caco-2和 HT-29 细胞生长，且这一
变化在实验范围内存在剂量依赖性。

细胞凋亡是由基因控制的一种自主的有序的细胞死亡。

显微镜下显示：当不同剂量的
20(S)-G-Rh2 作用 48h 后的人结肠癌细胞HT-29 出现凋亡细胞形态，而对照组处理的人结
肠癌细胞 HT-29 仅出现少数的凋亡细胞。

综上所述， 20(S)-G-Rh2 体外抑制人结肠癌Caco-2 和 HT-29细胞的增殖，可能与细胞周
期阻滞有关，也很可能与诱导部分细胞发生凋亡有密切关系，将有待于进一步探讨。

随着对
人参皂苷药理作用及其机制的深入了解，人参皂苷将在临床防治肿瘤方面具有广泛的应用前
景。

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