高效液相色谱法分离测定药酒中乌头碱的含量

高效液相色谱法分离测定药酒中乌头碱的含量
李红海;余陆生;金鸣
【摘要】目的建立药酒中乌头碱的高效液相色谱快速分析方法.方法以白酒添加乌头碱对照品对药酒样品的前处理方法、仪器测试条件、线性范围、精密度、回收率进行全面考察,建立定量分析方法.对药酒中所含乌头碱的浓度进行测定.结果该方法乌头碱在药酒中的线性范围是0.45～9.0μg·mL-1;日内、日间精密度分别小于3.1%和4.7%;回收率在(97.3±2.8)%以上.结论所建方法实用、便捷,可对药酒中乌头碱的含量进行快速检测.
【期刊名称】《法医学杂志》
【年(卷),期】2005(021)001
【总页数】3页(P34-35,38)
【关键词】法医毒物分析;乌头碱;药酒;高效液相色谱
【作者】李红海;余陆生;金鸣
【作者单位】岳阳市公安局刑警支队,湖南,岳阳,414000;岳阳市公安局刑警支队,湖南,岳阳,414000;华中科技大学同济医学院,湖北,武汉,430030
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.4
乌头碱是毒性强、作用快的二萜类生物碱，是乌头中毒性最大的成分，成人经口最小致死量为2mg［1］。

我国中医药理论中有乌头入药可治疗风湿和跌打损伤之说［2］，所以在民间常可以见到饮用乌头药酒治疗病患的习俗。

由于药酒中乌头成
分、含量未知，盲目和超量服用可造成中毒和致死，这类案件在法医学实践中较为多见。

为判明案件的性质，对所饮药酒中乌头碱的定性、定量测定成为毒物分析的重要任务之一。

由于药酒中所含中药成分较多，分离和测定乌头碱一直是困扰分析工作者的一个难题。

薄层色谱法虽是应用较多的一种分离和分析方法［3-6］，但因其操作繁琐、费时、精确度较差而难以满足法医毒物分析快速测定之要求。

本文以高效液相色谱法对药酒中乌头碱成分的分离和分析方法进行了实验研究，建立起一个实用的乌头碱快速测定方法，并用于法医学实践，结果令人满意。

1.1 仪器
日本岛津LC-6型高效液相色谱仪，SPD6A紫外检测器，南京千谱色谱工作站；TGL-16G台式高速离心机。

1.2 药品与试剂
乌头碱对照品由湖北省公安厅刑警总队技术室提供；乙腈（优级纯），溴化四丁铵、甲醇、乙醚、氨水均为分析纯，双蒸水。

1.3 实验溶液及配制
乌头碱标准溶液：准确称量乌头碱对照品1.8mg，用甲醇定容于10mL容量瓶中，得到0.18mg·mL-1的乌头碱贮备液。

精密吸取上述贮备液5.0mL定容至10 mL，配制成为90μg·mL-1的乌头碱工作溶液备用。

0.005 mol·L-1溴化四丁铵溶液:准确称取16.14g溴化四丁铵溶于100 mL双蒸
水中，配成浓度为0.5 mol·L-1的溶液备用，使用时稀释100倍。

2.1 药酒样品的前处理
取药酒0.5mL于离心试管中，N2气流吹至近干时，加0.5mL氨水混匀，用4mL 乙醚振摇提取10min，3000r·min-1离心10min，吸取上层清液，N2气流吹干，残留物用0.4mL甲醇溶解，吸取20μL进样检测。

2.2 色谱条件
色谱分离柱：HypersilODS2柱(200mm×4.6mm, 5μm)；流动相：V
（0.005mol·L-1溴化四丁铵溶液）∶V（乙腈）＝70∶30；检测波长：235 nm；流速：1 mL·min-1；进样量：20μL；柱温：32℃，在此色谱条件下，乌头碱的保留时间为9.587min。

2.3 HPLC检测条件
2.3.1 标准工作曲线和线性范围
取对照用白酒6份（每份0.5mL）于离心试管中，分别加入90μg·mL-1的乌头碱工作溶液，配制成质量浓度(ρ)为0.45，0.9，1.8，3.6，5.4，9.0μg·mL-1的标准乌头碱药酒样品，按2.1项方法处理样品后，在上述色谱条件下，分别进样20μL，测出其峰面积，由峰面积（y）与标准乌头碱药酒浓度（x）进行线性回归，得到
标准乌头碱药酒样品中的乌头碱浓度的回归方程，即y=197 936x+66 089，其相关系数r＝0.998 8，线性范围0.45～9.0μg·mL-1。

2.3.2 精密度
取质量浓度（ρ）为0.9，3.6，9.0 μg·mL-1的乌头碱药酒样品经处理后，分别于同一日内5个不同时间点及不同日内连续测定5日，由测得浓度计算标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)，获得日内、日间精密度值，各次测量结果的RSD分别在3.1%和4.7%以内（表1），精密度符合要求，测定方法可靠。

2.3.3 回收率
配制质量浓度（ρ）为0.9，4.5，9.0μg·mL-1的乌头碱药酒样品，经样品前处理
后在上述色谱条件下分别测试(n=5)，由测得质量浓度（ρx）计算回收率，乌头酒样品的回收率为（97.3±2.9）%～（100.4±3.7）%（表2），符合定量分析的要求。

2.3.4 HPLC色谱图（图1）
某男，58岁，一次性饮用自制含高浓度乌头的药酒100mL以上，约20min后相
继出现口、唇、脊柱发麻等症状，经医院抢救无效于1h后死亡。

法医提取药酒和死者心血立即送检，采用上述HPLC分析方法进行测定，所饮药酒和死者心血中均检出乌头碱成分，药酒中乌头碱浓度为45.6μg·mL-1。

死者饮用了该药酒在100mL以上，实际摄入乌头碱的量已大于4.6mg，超出成人口服乌头碱致死量的两倍以上。

本研究对三种流动相进行了考察：(1)V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）＝105∶95∶1;(2)V（甲醇）∶V（水）∶V（氯仿）∶V（三乙胺）＝
70∶30∶3∶0.2;(3)V（0.005mol·L-1溴化四丁胺）∶V（乙腈）＝70∶30，结果证实流动相（3）出峰时间适宜，色谱峰形较好，可与药酒中其他中药成份有效地分离。

【相关文献】
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[2]陈昕.乌头类药物的研究进展［J］.时珍国医国药，2002,13(12):758-759.
[3]陈巧玲.川乌、草乌、附子及其复方制剂中乌头类生物碱的含量测定研究概况[J].华西药学杂志, 1999,14(2)：114-116.
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