Ca~(2+)增敏米诺环素荧光显微成像技术应用于米诺环素的检测

Ca~(2+)增敏米诺环素荧光显微成像技术应用于米诺环素的
检测
杨乐;刘颖;周姗姗
【摘要】应用固载表面毛细流自组装环荧光显微成像技术,建立了Ca~(2+)增敏米诺环素荧光体系测定牛奶中米诺环残留量的分析方法.将米诺环素溶液与一定量的氯化钙溶液,pH 8.50的氨性缓冲溶液及PVA-124溶液充分混合均匀.反应10 min 后,滴在疏水性载玻片表面上,微波加热,溶剂受热挥发后,形成直径约为1.7 mm,环带宽约为45.3 μm的自组装环.当点样体积为0.3μL时,线性范围为5.6×10~(-13)～1.8×10~(-11)mol,方法的检出限(3σ)为5.6×10~(-14)mol.应用于米诺环素胶囊中米诺环素和牛奶中残留米诺环素的检测,回收率分别为104.3%～105.0%和96.0%～105.9%,相对标准偏差(n=5)小于3.5%.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2010(046)001
【总页数】5页(P13-16,19)
【关键词】荧光显微成像技术;毛细流自组装环;米诺环素;牛奶
【作者】杨乐;刘颖;周姗姗
【作者单位】中央民族大学生命与环境科学学院,北京,100081;中央民族大学生命与环境科学学院,北京,100081;内蒙古师范大学化学与环境科学学院,呼和浩
特,010022;中央民族大学生命与环境科学学院,北京,100081
【正文语种】中文
【中图分类】O657.32
近年来不断发生的乳品卫生事件引起了公众对牛奶饮用安全的重视。

抗生素是一种广泛用于治疗牛乳腺炎的药物,而它的不适当应用可导致牛奶污染[1],如牛奶中抗生素残留可能引起过敏症状,还可能增强细菌的耐药性[23]。

米诺环素(简写MC)(图1),又称二甲胺四环素、美满霉素,为半合成的四环素类抗生素,抗菌谱与四环素相近,具有高效和长效性质,在四环素类中抗菌作用最强[4]。

目前的测定方法主要为高效
液相色谱法[57],该方法具有分离效率高、假阳性少等优点,但处理过程复杂、耗时
比较长、成本高。

米诺环素的分子结构具有大的共轭键结构和刚性平面结构,因而具有荧光性质[8]。

固载表面毛细流自组装成环(简称SOR)荧光显微成像技术是近年新兴的分析方法,
具有灵敏度高、检出限低、共存离子干扰小等优点,已应用于盐酸小檗碱[9]、四环
素[1011]等药物的分析研究。

本工作应用该技术建立了Ca2+增敏米诺环素荧光体系,在氨水氯化铵缓冲溶液和聚乙烯醇124(PVA124)存在下,将米诺环素液滴滴在疏水性玻璃表面上形成具有较强荧光的自组装环,与Ca2+离子作用形成络合物后,体
系荧光强度进一步增强且稳定[12],方法应用于牛奶中米诺环素残留量的检测,得到
了满意的测定结果。

IX81倒置荧光显微镜,选用U激发单元,激发滤光片波长范围 330～385 nm,电荷耦合元件(CCD)配套采图软件DPController。

疏水性载玻片[10]:先用洗涤剂超声清洗载玻片,再用铬酸洗液浸泡,以清除表面有机杂质,然后用二次蒸馏水和丙酮清洗,氮气吹干,室温条件下在二氯二甲基硅烷(DMCS)甲苯溶液中浸泡约30 min,最后将载玻片取出,依次浸入氯仿、丙酮中各5 min,用氮气吹干备用。

米诺环素标准溶液:称取米诺环素0.045 7 g,用少量0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液溶解后,定容于100 mL容量瓶中,配成1.0×10-3 mol·L-1标准储备溶液,并保存于0～4℃
冰箱中,使用时稀释成1.0×10-4 mol·L-1标准工作溶液。

试验所用试剂均为分析纯,水为三次蒸馏的纯水。

1.2.1 样品预处理
(1)药品:玫满米诺环素胶囊(50 mg·粒-1),称取装量差异项下的内容物适量(约相当于米诺环素50 mg),置100 mL容量瓶中,加水80 mL,超声处理5 min后,加水稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为米诺环素试样溶液。

(2)牛奶试样:分别移取不同厂家的牛奶1 mL于200 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,冷藏备用。

1.2.2 样品分析
向1.5 mL微量试管中,分别加入一定量的1.0×10-4 mol·L-1米诺环素标准工作溶液,1.0×10-4 mol·L-1氯化钙溶液75μL,pH 8.50的氨水氯化铵缓冲溶液100μL,涡流混匀后加入10 g·L-1 PVA124溶液130μL,用纯水定容至0.5 mL,摇匀,放置10 min。

移取一定体积的混合液小心地滴加在疏水性载玻片表面上,然后将其置于微波炉中高火烘干1.5 min,在倒置荧光显微镜下对SOR进行图像分析,测定米诺环素的荧光强度 F及空白溶液的荧光强度 F0,以ΔF(ΔF=F-F0)作为测定米诺环素的信号响应值,用 ImagePro Plus中文版6.0图像处理软件测定荧光强度,Origin 7.5软件用于线性、高斯拟合等相关分析。

图2(A)为米诺环素自身体系的SOR,图2(B)为Ca2+增敏米诺环素体系的 SOR,使用4倍物镜(米诺环素浓度为1.5×10-5 mol·L-1,Ca2+溶液浓度为1.5×10-5 mol·L-1,pH 8.50氨水氯化铵缓冲溶液100μL,PVA124溶液为2.6 g·L-1,液滴体积0.5μL),可以看出,敏化体系荧光强度较自身荧光有明显提高。

图2(B)米诺环素SOR 环直径约为1.7 mm,环线宽约为45.3μm,呈蓝色。

由图3可知:米诺环素的荧光强度呈径向分布,液滴中Ca2+增敏的米诺环素几乎都沉积在环线上,环内外几乎没有荧光物质分布。

将峰a和峰b荧光强度(F)分别对径
向距离(pixels)进行高斯拟合(图4),得高斯拟合曲线:
式中:F a、F b是a、b两峰各自的荧光强度;x是通过自组装环圆心的径向方向上,
自组装环上的点与原点的距离(pixels,像素单位);χ2值反映拟合符合程度,且两值相近,表明米诺环素在环线上的径向分布符合高斯分布,a,b两峰的半峰宽分别为
σa=7.89 pixels,σb=7.95 pixels(pixel像素单位),说明环线上米诺环素分布较均匀。

为考察并行处理的疏水性载玻片表面性质的相似程度,在三张不同的疏水性载玻片
上试验了0.2～1.6μL范围内的液滴,得到了SOR的半径(R)与液滴体积(V)的关系,
结果如图5所示,线性拟合方程依次为:R1=570.68 V 1/3-94.35,r=0.999
2;R2=549.72 V 1/3-97.21,r= 0.999 5;R3=574.13 V 1/3-104.57,r=0.999 6。

这个结果与文献[9]证明的 SOR半径与液滴体积的关系 R=K V1/3(K为常数,与载玻
片及溶液的性质有关)相吻合,三条线性拟合方程 K值相差不大,说明并行处理的载玻片表面性质几乎相似,以保证试验有良好的重现性。

2.3.1 反应时间
试验了加入试剂溶液放置3,5,7,10,30,60 min后荧光强度的变化,结果表明:10 min 前荧光强度随放置时间增大而增强,10 min之后荧光强度随放置时间增大而降低。

试验选用10 min为络合反应时间。

2.3.2 酸度
米诺环素的荧光强度依赖于溶液的pH值。

试验了 TrisHCl、BR、氨水氯化铵和六氢吡啶等反应介质,试验发现:使用氨水氯化铵介质时成环均匀,空白背景值低,环内盐晶少。

米诺环素的荧光强度在一定范围内随pH值的增大而增大,当pH值为8.50时,SOR环的荧光强度达到最大值;当pH值继续增大时,SOR环的荧光强度降低。

试验选用pH 8.50的氨水氯化铵缓冲溶液作为米诺环素的成环介质。

2.3.3 PVA124用量
PVA124为辅助成环剂。

在自组装成环中,PVA124溶液的用量对米诺环素的成环
效果、环线宽有较大影响。

试验结果表明:当PVA124溶液的质量浓度为2.6 g·L-1时,荧光强度最大,且成环效果好。

当液滴体积为0.5μL,米诺环素浓度为1.0×10-5 mol·L-1,相对误差在±10%范围时,以下共存物质不干扰测定:1.0×10-4 mol·L-1的 K+、Zn2+、Al3+、Mn2+、麦芽糖、尿素,1.0 ×10-5 mol·L-1的 Na+ 、Cr2+ 、Fe3+ 、维生素B5、赖氨酸、甘氨酸、蔗糖,1.0×10-2 g·L-1牛血清白蛋白和人血清白蛋白,1.5×10-3 g·L-1淀粉溶液。

试验了不同点样体积与检出限之间的关系。

点样体积越小,检出限越低,当点样体积为0.3,0.5,1.0μL时,线性范围和检出限(3σ)结果见表1。

与自身荧光体系相比(图
2A),灵敏度提高了7.5倍。

按试验方法对米诺环素胶囊样品和牛奶样品溶液进行测定,同时进行加标回收试验,结果见表2。

米诺环素胶囊中米诺环素的测定结果与标示值(50 mg·粒-1)接近,加标回收率为104.3%～105.0%,相对标准偏差为1.0%。

对牛奶试样进行测定,均未检出残留的米诺环素,其加标回收率在96.0%～105.9%,相对标准偏差小于4.0%。

感谢中央民族大学中国少数民族传统医学研究院崔箭院长、徐斯凡副院长和申刚义博士的大力支持和帮助。

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