拟南芥自噬蛋白ATG8e的原核表达及多克隆抗体制备

自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是真核生物中进化保守的、对细胞内物 质如蛋白质或细胞器进行降解、促进物质循环利用的重要过 程［１－２］。在自噬发生的过程中，生物体先形成 １个自噬吞噬 泡（ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ），将细胞质物质包裹起来，吞噬泡逐渐形成 １ 个双层膜 自 噬 体 （ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ），其 外 膜 会 与 液 泡 膜 融 合， 内膜及其包裹物（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｂｏｄｙ）进入到液泡腔被水解酶分 解［３］。研究表明，一系列自噬基因（ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ， 简称 ＡＴＧ）会组成功能单元参与自噬进程，如其中参与成膜 过程的 ２个类泛素化系统———ＡＴＧ８耦合系统 和 ［４］ ＡＴＧ１２耦 合系统 ［５－６］。ＡＴＧ８蛋白在自 噬 中 发 挥 作 用 是 一 个 类 泛 素 化 的过程，ＡＴＧ８蛋白前体的 Ｃ端被 ＡＴＧ４剪切，使其 Ｃ端甘氨 酸残基暴露，接着被剪切后的 ＡＴＧ８会在 ＡＴＧ７（Ｅ１类似酶） 催化下结 合 ＡＴＧ３（Ｅ２类 似 酶 ），然 后 在 ＡＴＧ１２－ＡＴＧ５· ＡＴＧ１６（“－”代 表 共 价 结 合，“· ”代 表 非 共 价 结 合 ）复 合 物 （Ｅ３类似酶）作用下，ＡＴＧ８可以与磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）连接组 成 ＡＴＧ８－ＰＥ［４］。ＡＴＧ８－ＰＥ锚定于自噬体膜上，参与自噬体 膜的形成［７］。因此可根据 ＡＴＧ８－ＰＥ的积累量来衡量植物的 自噬程度，从而比较不同基因型植物之间自噬发生的差异，筛 选能参与自噬调控途径的新基因，对于揭示植物自噬的分子 途径具有重要意义。
刘 希，李远凤，齐亚飞，郁 飞
（旱区逆境生物学国家重点实验室 ／西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 ７１２１００）
摘要：构建拟南芥自噬相关基因 ＡＴＧ８ｅ的原核表达载体 ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＡＴＧ８ｅ，转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株， 并用异丙基 －β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导得到融合蛋白 ＧＳＴ－ＡＴＧ８ｅ。ＧＳＴ－ＡＴＧ８ｅ蛋白首先用谷胱甘肽琼脂 糖凝胶树脂亲和纯化，然后用凝血酶酶切去除谷胱甘肽 Ｓ移换酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，简称 ＧＳＴ）标签，最后十二 烷基硫酸钠 －聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，简称 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）割胶 纯化，用纯化后 １４ｋｕ的 ＡＴＧ８ｅ蛋白免疫家兔 ４次得到抗血清，纯化抗血清制备高效 ＡＴＧ８ｅ多克隆抗体。提取野生 型拟南芥和 ＡＴＧ８ｅ超表达植株叶片总蛋白做免疫印迹检测，结果在 ２种基因型植物叶片蛋白样品中均能检测到与 ＡＴＧ８ｅ分子量大小一致的条带，且 ＡＴＧ８ｅ超表达植物中 ＡＴＧ８ｅ积累量明显高于野生型。成功制备了拟南芥 ＡＴＧ８ｅ蛋 白多克隆抗体，为研究 ＡＴＧ８ｅ在自噬中的作用奠定了试验基础。 关键词：自噬蛋白；ＡＴＧ８ｅ；蛋白纯化；多克隆抗体制备；免疫印迹 中图分类号：Ｑ９４３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１８－００４７－０４
江苏农业科学 ２０１８年第 ４６卷第 １８期
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刘 希，李远凤，齐亚飞，等．拟南芥自噬蛋白 ＡＴＧ８ｅ的原核表达及多克隆抗体制备［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１８）：４７－５１． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１８．０１２
拟南芥自噬蛋白 ＡＴＧ８ｅ的原核表达及多克隆抗体制备
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 １．１．１ 植物、细菌和载体 野生型拟南芥 Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）、大 肠杆菌 ＴＯＰ１０菌株、大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株、野生型拟南 芥 ｃＤＮＡ、农杆菌 ＧＶ３１０１菌株、二元载体 ｐＢＩ１１１Ｌ［１２］、原核表 达载体 ｐＧＥＸ－４Ｔ－１均由笔者所在实验室留存。 １．１．２ 试 剂 高 保 真 ＤＮＡ聚 合 酶 （ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ），ＢａｍＨ Ｉ和 ＥｃｏＲＩ内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购于 ＴａＫａＲａ公 司；ＤＮＡ 纯 化 回 收 试 剂 盒 （ＵｎｉｖｅｒｓａｌＤＮＡ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）、质 粒 小 提 试 剂 盒 （ＴＩＡＮｐｒｅｐＭｉｎｉＰｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）购于天根生化科技（北京）有限公司；异丙基 －β－Ｄ－硫 代半 乳 糖 苷 （ＩＰＴＧ）、弗 氏 完 全 佐 剂 （Ｆｒｅｕｎｄｓａｄｊｕｖａｎｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）和弗氏不完全佐剂（Ｆｒｅｕｎｄｓａｄｊｕｖａｎｔｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）购 于 Ｓｉｇｍａ公司；ＧＳＴ标签蛋白纯化柱填料 ｐｒｏｔｅｉｎＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ ＦａｓｔＦｌｏｗ、凝 血 酶 （Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、表 面 活 性 剂 （ＳＩＬＷＥＴ Ｌ －７７）、０４５μｍ硝酸纤维素（ＮｉｔｒｏＣｅｌｌｕｌｏｓｅ）膜 购于 ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记 的羊抗兔免疫球蛋白 Ｇ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ，简称 ＩｇＧ）购于北 京康为世纪生物科技有限公司；尿素购于 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＥＣＬ 工作液 （Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ１，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ２）购 于 Ｂｉｏ－
自噬在植物的生长发育和胁迫响应中发挥重要作用。研 究表明，拟南芥中至少有 ３６个基因与酵母 ＡＴＧ基因同源且 具 有 相 似 作 用，参 与 植 物 的 免 疫 反 应 ［８］、叶 片 衰 老 及 环 境 胁 迫应答等［９］。为 了 研 究 植 物 自 噬，以 ＡＴＧ８家 族 ９个 成 员
收稿日期：２０１７－０３－２６ 基金项目：陕西省自然科学基金（编号：２０１５ＪＭ３０８１）。 作者简介：刘 希（１９９１—），女，陕西汉中人，硕士，主要从事植物分
子遗传学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１４６８５３８５０９＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：郁 飞，博士，教 授，博 士 生 导 师，主 要 从 事 植 物 分 子 遗 传
学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｌｙｆｅｉｙｕ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ。
（ＡＴＧ８ａ～ＡＴＧ８ｉ）［１０］之一的 ＡＴＧ８ｅ作 为 切 入 点，构 建 ＡＴＧ８ｅ 基因的原核表达载体，转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），用异丙基 硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，简称 ＩＰＴＧ）诱 导产生融合蛋白 ＧＳＴ－ＡＴＧ８ｅ，最后用切去谷胱甘肽 Ｓ移换 酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，简 称 ＧＳＴ）标 签 并 纯 化 过 的 ＡＴＧ８ｅ免疫家兔，心脏 采 血 后 收 集 血 清，制 备 多 克 隆 抗 体。 为证明制备的多克隆抗体的有效性，构建重组质粒 ｐＢＩ１１１Ｌ－ ＡＴＧ８ｅ，利用花序 侵 染 法 转 ［１１］ 化 野 生 型 拟 南 芥，得 到 ＡＴＧ８ｅ 超表达植物，提取野生型拟南芥和 ＡＴＧ８ｅ超表达植物叶片总 蛋白，用于免疫印迹检测。