一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010730869.7
(22)申请日 2020.07.27
(71)申请人 华南农业大学
地址 510642 广东省广州市天河区五山路
483号
(72)发明人 陈瑞爱　杜倩茹　刘定祥　黄梅　
王楠楠　叶俊贤　罗琼　任广彩　
(74)专利代理机构 广州市科丰知识产权代理事
务所(普通合伙) 44467
代理人 龚元元
(51)Int.Cl.
C12N 7/01(2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
A61K 39/295(2006.01)
A61K 39/17(2006.01)
A61K 39/12(2006.01)A61P 31/14(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称
一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基
因Ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗
(57)摘要
本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了
一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ
型新城疫重组病毒，所述重组病毒在病毒
rDHN3mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码
基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ
ID NO：2所述，所述病毒rDHN3‑mF的序列表如SEQ
ID NO：1所述。

该重组病毒为弱毒型、应用后具有
较强烈的保护性免疫反应、是针对流行毒株的
NDV/IBDV二联疫苗的具有实用性的潜在毒株，同
时本发明还公开了该重组病毒的制备方法和疫
苗。

权利要求书1页 说明书11页序列表20页 附图7页CN 112048484 A 2020.12.08
C N 112048484
A
1.一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，其特征在于，所述重组病毒在病毒rDHN3-mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ ID NO：2所述，所述病毒rDHN3-mF的序列表如SEQ ID NO：1所述。

2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由基因片段F1、F2、F3、F4通过同源重组的的方法得到质粒pBR322-DHN3mF -IBDVvp2，并将质粒pBR322-DHN3mF -IBDVvp2通过转染细胞得到；
所述基因片段F1的序列表如SEQ ID NO：3所述；
所述基因片段F2的序列表如SEQ ID NO：4所述；
所述基因片段F3为VP2蛋白编码基因；
所述基因片段F4的序列表如SEQ ID NO：5所述。

3.一种如权利要求2所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将基因片段F1、F2、F3、F4进行同源重组得到重组产物pBR322-DHN3mF -IBDVvp2；
将质粒pBR322-DHN3mF -IBDVvp2通过转染细胞得到重组病毒。

4.根据权利要求3所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，重组过程中各物质用量为：30ng 基因片段F1、97ng 基因片段F 2、30ng 基因片段F 3、200ng 基因片段F 4、4μl5xCEMultiSBuffer、2μlExnaseMultiS，ddH 2O添加至20μl；
反应条件为37℃反应30分钟。

5.根据权利要求4所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，转染过程中，转染的细胞为BHK -21细胞，转染试剂的各组分如下：
A液：Opti -MEM Medium 150μl ,Lipofectamine LTX Reagent 15μl；
B液：Opti -MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF -IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P
1.25μg，pXJ40-L 1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl；
A液和B液各150μl。

6.根据权利要求5所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，转染的操作如下：
(1)将BHK -21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNA Transfection Reagents转染试剂盒进行转染；
(2)转染试剂配制如下：
A液静置5min；B液吹打混匀，静置5min；
取A液B液各150μl混合均匀得到混合液，静置20min；
取250μl混合液转染BHK -21细胞得到转染细胞；
(3)4天后将上述转染细胞置-80℃冻存得到冻存细胞；
(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃ 10000/rpm离心5分钟得到含病毒的病毒液。

7.一种疫苗，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的重组病毒。

权　利　要　求　书1/1页CN 112048484 A
一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重
组病毒和疫苗
技术领域
[0001]本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒以及制备方法和疫苗。

背景技术
[0002]传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性、高传染性、免疫抑制性疾病。

该病毒有两种血清型即I型和II 型血清型，但只有I型血清型对鸡有致病作用。

它主要侵害3-6周龄雏鸡的中枢神经系统和法氏囊器官中的B细胞，引起法氏囊充血坏死，免疫抑制，继发其它感染性疾病，是造成全球家禽业重大损失的重要病原之一。

[0003]IBDV是一种具有二十面体核衣壳结构的无包膜双链RNA(dsRNA)病毒，属于双链RNA病毒科，双链RNA病毒属[1]。

病毒基因组由大片段A和小片段B两段双链RNA组成。

IBDV全基因组成如图1所示。

[0004]目前，商业鸡中的IBD是通过弱毒和灭活的IBDV疫苗来控制的。

弱毒活疫苗存在一定的安全隐患，弱毒的活病毒在环境中的传播可以造成病毒突变和重组形成新的毒株，从而导致病毒变异[7,8]；但灭活疫苗在生产和使用方面更加耗时，耗力，成本更高[5,6]。

如果使用病毒载体来表达IBDV则可形成二联苗达到一石击二鸟的效果，既节约成本又能降低安全隐患。

研究表明，VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白，也是IBDV主要的保护性抗原基因；VP2蛋白在病毒毒力、细胞嗜性、引起细胞调亡等方面起着重要的作用[2,3,4，9]。

[0005]新城疫病毒(NDV)是一种高度传染性和致命性疾病的病原体，已经影响全世界的家禽和其他禽类工业。

NDV的强毒株能够在未接种疫苗的鸡中引起高死亡率(高达100％)[10]。

该病引起的主要临床症状包括呼吸困难、高热、下痢、神经紊乱和黏膜出血等[11]。

NDV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)禽副黏病毒Ⅰ型(Avian Paramyxovirus typeⅠ，APMV-1)的唯一成员⑴。

NDV属于不分节段的单股负链RNA病毒[12]。

该基因组包含的3'-前导序列和5'-尾部序列，是病毒转录和复制所必需的[13]。

NDV具有六个结构蛋白：即核衣壳蛋白NP(nucleocapsid protein)、磷酸化蛋白P(phoshopprotein)、基质蛋白M(matrix protein)、融合蛋白F (fusion protein)、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN(Hemagglutinin-Neuraminidase)和依赖RNA的RNA大聚合酶蛋白(Large RNA-dependent RNA polymerase protein L)[14]。

[0006]随着反向遗传技术的广泛应用，世界各地科学家己经证实了新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为控制人类和动物疾病的疫苗载体候选株的潜力。

NDV 作疫苗载体有以下优点：
[0007]①与痘病毒和疱疹病毒载体相比，NDV基因组编码的个结构蛋白数量少，仅6个，这有助于在免疫过程中产生针对目的基因的特异性免疫应答；
[0008]②NDV遗传相对比较稳定；
[0009]③NDV能够在鸡胚、许多禽类和非禽类的细胞系中高效复制；
[0010]④NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产；
[0011]⑤NDV载体自身能够表达NDV抗原，能产生对全身和粘膜免疫的广泛性保护应答，并且在许多动物模型中被证实是安全的[15]。

[0012]参考文献如下：
[0013][1]Azad,A.A.,Barrett,S.A.,Fahey,K.J.,1985.The Characterization and Molecular-Cloning of the Double-Stranded-Rna Genome of an Australian Strain of Infectious Bursal Disease Virus.Virology143(1),35-44.
[0014][2]Brandt,M.,Yao,K.,Liu,M.,Heckert,R.A.,Vakharia,V.N.,2001.Molecular determinants of virulence,cell tropism,and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus.J Virol75(24),11974-11982.
[0015][3]Coulibaly,F.,Chevalier,C.,Gutsche,I.,Pous,J.,Navaza,J., Bressanelli,S.,Delmas,B.,Rey,F.A.,2005.Thebirnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses.Cell120(6),761-772.
[0016][4]Letzel,T.,Coulibaly,F.,Rey,F.A.,Delmas,B.,Jagt,E.,van Loon,A.A., Mundt,E.,2007.Molecular andstructural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus.J Virol81(23),12827-12835.
[0017][5]Meeusen,E.N.T.,Walker,J.,Peters,A.,Pastoret,P.P.&Jungersen, G.Current status of veterinary vaccines.Clinical MicrobiologyReviews.20,489–510(2007).
[0018][6]Bande,F.,Arshad,S.S.,Bejo,M.H.,Moeini,H.&Omar,A.R.Progress and challenges toward the development of vaccines againstavian infectious bronchitis.Journal of Immunology Research.ID 424860(2015).
[0019][7]McKinley,E.T.,Hilt,D.A.&Jackwood,M.W.Avian coronavirus infectious bronchitis attenuated live vaccines undergo selection ofsubpopulations and mutations following vaccination.Vaccine.26,1274–1284(2008).
[0020][8]Lee,S.W.et al.Attenuated vaccines can recombine to form virulent field viruses.Science.337,188(2012)
[0021][9]Brandt M,Yao K,Liu M,et al.Molecular determinants of virulence, cell tropism,and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus[J] .Journal of Virology,2001,75(24):11974.
[0022][10]Hines NL,Miller CL.Avian paramyxovirus serotype-1:a review of diseasedistribution,clinical symptoms,and laboratory diagnostics.Vet Med Int.2012；2012:708216.
[0023][11]葛金英.新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究[D].南京农业大学,2006. [0024][12]Dortmans J C,Koch G,Rottier P J,et al.Virulence of Newcastle disease virus:what is known so far？[J].Vet Res.2011,42:122.
[0025][13]Peeters BP,Gruijthuijsen YK,de Leeuw OS,Gielkens AL.Genome
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[0026][14]Calain P,Roux L(1993)The rule of six,a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.J Virol 67:4 822–4 830
[0027][15]刘晶晶.重组嵌合新城疫病毒载体的构建及其在H7N9和H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用[D].扬州大学,2018.
[0028]现有的新城疫病毒作为疫苗载体候选株大多为强毒株，其毒性高。

[0029]本发明所要解决的技术问题是：如何针对传染性法氏囊病、新城疫病毒开发出弱毒型的二联疫苗用的病毒。

发明内容
[0030]本发明的目的在于提供一种表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，该重组病毒为弱毒型、应用后具有较强烈的保护性免疫反应、是针对流行毒株的NDV/IBDV二联疫苗的具有实用性的潜在毒株，同时本发明还公开了该重组病毒的制备方法和疫苗。

[0031]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，所述重组病毒在病毒rDHN3mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ ID NO：2所述，所述病毒rDHN3-mF的序列表如SEQ ID NO：1所述。

[0032]在上述的重组病毒中，所述重组病毒由基因片段F1、F2、F3、F4通过同源重组的的方法得到质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2，并将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到；
[0033]所述基因片段F1的序列表如SEQ ID NO：3所述；
[0034]所述基因片段F2的序列表如SEQ ID NO：4所述；
[0035]所述基因片段F3为VP2蛋白编码基因；
[0036]所述基因片段F4的序列表如SEQ ID NO：5所述。

[0037]同时本发明还公开了一种如上所述的重组病毒的制备方法，包括如下步骤：[0038]将基因片段F1、F2、F3、F4进行同源重组得到重组产物pBR322-DHN3mF-IBDVvp2；[0039]将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到重组病毒。

[0040]在上述的重组病毒的制备方法中，重组过程中各物质用量为：30ng基因片段F1、97ng基因片段F2、30ng基因片段F3、200ng基因片段F4、4μl5xCEMultiSBuffer、2μlExnaseMultiS，ddH2O添加至20μl；
[0041]反应条件为37℃反应30分钟。

[0042]在上述的重组病毒的制备方法中，转染过程中，转染的细胞为BHK-21细胞，转染试剂的各组分如下：
[0043]A液：Opti-MEM Medium 150μl,Lipofectamine LTX Reagent 15μl；
[0044]B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L 1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl；
[0045]pXJ40-NP，pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3的制备可参考CN201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书108-153段；
[0046]A液和B液各150μl。

[0047]在上述的重组病毒的制备方法中，转染的操作如下：
[0048](1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNA Transfection Reagents转染试剂盒进行转染；
[0049](2)转染试剂配制如下：
[0050]A液静置5min；B液吹打混匀，静置5min；
[0051]取A液B液各150μl混合均匀得到混合液，静置20min；
[0052]取250μl混合液转染BHK-21细胞得到转染细胞；
[0053](3)4天后将上述转染细胞置-80℃冻存得到冻存细胞；
[0054](4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃10000/rpm离心5分钟得到含病毒的病毒液。

[0055]最后，还公开了一种疫苗，含有如上所述的重组病毒。

[0056]本发明的有益效果在于：
[0057]本发明将传染性法氏囊病毒IBDVLYZS株的VP2基因通过DNA重组的方法插进新城疫基因VII型DHN3mF弱毒株的M和P基因之间，构建了一株感染性cDNA克隆pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。

[0058]将该克隆cDNA与pXJ40-NP，pXJ40-，pXJ40-L，pXJ40-DE3共转染BHK-21细胞，成功获得一株稳定的能高效表达IBDVVP2和NDV抗原蛋白的重组病毒rDHNmF-IBDVvp2。

[0059]该病毒有望进一步开发成抗IBDV和抗NDV的二联疫苗，为控制鸡传染性法氏囊病和新城疫提供新的防御方法。

附图说明
[0060]图1为背景技术中IBDV全基因结构图谱。

[0061]图2为本发明的基因片段F1、F2的跑胶图谱；
[0062]图3为本发明的基因片段F3的跑胶图谱；
[0063]图4为本发明的基因片段F4的跑胶图谱；
[0064]图5为本发明的单菌落筛选结果图；
[0065]图6为本发明的质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2的跑胶图谱；
[0066]图7为BHK-21细胞感染病毒和未感染病毒的图像；
[0067]图8为重组病毒RT-PCR产物跑胶图谱；
[0068]图9为重组毒rDHN3mF-IBDVvp2的F1、F5、F10代鸡胚尿囊液中提取RNA并用其进行RT-PCR产物跑胶图谱；
[0069]图10为WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白的蛋白胶图谱；[0070]图11为WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白的蛋白胶图谱；[0071]图12为质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2的质粒构造图；
[0072]图13为质粒pBR322-mFDHN3的质粒构造图。

具体实施方式
[0073]下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。

本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。

[0074]实施例一
[0075]一、实验材料
[0076]主要仪器设备
[0077]电热恒温培养箱HZ-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒温水槽DK-8D(一恒科学仪器有限公司,中国上海)；海尔BCD-579WE冰箱(海尔，中国上海)；CO2恒温培养箱Forma371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIESA2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；高速离心机Centrifuge5804R(Eppendorf公司，德国)；移液器Researchplus (Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000Touch(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪PowerPacBasic (Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽MiniProteanTetra(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)；超纯水仪Milli-Q(Millipore公司，美国)；超低温冰箱Forma994(Thermo公司，美国)；核酸蛋白分析仪NanoDrop2000(Thermo公司，美国)；生化培养箱LRH-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；分析天平BSA224S(Sartorius公司，德国)；涡旋振荡器(Thermo公司，美国)；AzureBiosystemsC600多功能分子成像系统(AzureBiosystems公司，美国)。

[0078]主要试剂和材料
[0079]TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic (C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Strep penicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；BtgZ1(R0703S)，高浓度T4 DNA Ligase(M0202M)购自NEB；T4连接酶及其他常用限制性内切酶均购自TAKARA；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113)购自南京诺维赞生物制品有限公司；Trizol 15596-026购自Invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司；10xSDS-PAGE电泳液购自碧云天；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天；IRDye 680RD Goat anti-Mouse (926-68070)购自LIC，TBS缓冲液购自博士德生物公司。

pBR322-DHN3mF，pXJ40-NP，pXJ40-P，pX J40-L，pXJ40-DE3均为华农(肇庆)生物技术研究院提供。

PUC57-VP2购自金唯智(广州)生物科技有限公司；DH5α、SOC培养基购自TAKARA；LB平板固体培养基购自海博生物(产品编号：HB0128)。

[0080]二、试验过程
[0081] 1.构建表达IBDV强毒株VP2基因的新城疫病毒重组质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 [0082](1)以质粒pBR322-mFDHN3载体为模板用分别用引物：FDHN3-F1(序列表SEQ ID
NO：6)/FDHN3-SmaI-R1(序列表SEQ ID NO：7)、FDHN3-SmaI-F2(序列表SEQ ID NO：8)/ FDHN3-R2(序列表SEQ ID NO：9)扩增长度为1463bp的F1片段，长度为4845bp的F2片段。

[0083]以PUC57-VP2载体为模板，用引物VP2-F(序列表SEQ ID NO：10)/VP2-R(序列表SEQ ID NO：11)扩增1个长度为1366bp的F3片段。

F3片段即为VP2蛋白编码基因，F3片段；VP2蛋白的氨基酸序列为参考SEQ ID NO：16。

[0084]PUC57-VP2是从金唯智生物公司合成的含IBD VLYZS株VP2编码基因的质粒(引物序列和VP2序列见附表，昆虫细胞表达的该IBDV LYZS株VP2具有很强的抗原活性，能针对IBDV BC6/85攻毒产生良好的保护反应(专利号：CN201110442781.6))。

[0085]上述PCR反应条件如下：
[0086]PCR反应液的配制参考表1：
[0087]表1：PCR反应液配方
[0088]5×PrimeSTAR GXL Buffer10μl
1×dNTP Mixture(2.5mM each)4μl
Primer 110pmol
Primer 210pmol
Template1μl
GXL DNA Polymerase1μl
ddH2O up to 50μl
[0089]PCR反应参数如下：
[0090]98℃30s、98℃10s、60℃15s、68℃10s/kb、68℃5min；
[0091]98℃10s、60℃15s、68℃10s/kb循环35次。

[0092]用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，通过胶纯化13996bpDNA片段F4；
[0093]基因片段F1、F2、F3、F4跑电泳后的条带图参考图2-4。

[0094]图2中，F1片段回收大小：1463bp，F2片段回收大小：4845bp。

[0095]图3中，F3片段为VP2的回收片段大小：1366bp；
[0096]图4中，F4是质粒pBR322-mFDHN3经SmaI酶切回收大小：13996bp；
[0097]其中，质粒pBR322-mFDHN3载体的制备方法为：
[0098]用S m a I酶切质粒p B R322-D H N3(质粒p B R322-D H N3的制备可参考C N 201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书第182段至208段，3.1.4构建全基因组表达载体pBR322-DHN3),通过0.8％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(13399bp)待用。

酶切方法按说明书进行。

[0099]用两对引物change-F1-F/change-F1-R和change-F2-F/change-F2-R以pBR322-DHN3为模板扩增目的片段。

引物中包含突变的F碱基序列和与SmaI酶切质粒同源的同源序列，两对PCR产物互含有同源臂(详见下面序列表)。

第一对引物的PCR产物为3190bp；第二对引物的PCR产物为3106bp；。

[0100]表1构建质粒pBR322-mFDHN3的引物序列
[0101]
[0102]注：斜体序列为酶切位点，加粗序列为同源序列，当酶切位点同为同源序列时斜体加粗
[0103]将PCR产物纯化后与SmaI酶切后的质粒在重组酶的作用下同源重组，获得含mF的质粒pBR322-mFDHN3。

[0104]pBR322-mFDHN3质粒构造见下图13。

同源重组反应方法按说明书进行。

[0105](2)将上述4个片段共同进行如下同源重组(重组试剂盒购自南京诺维赞ClonExpressMultis One Step Cloning Kit，C113)：
[0106]同源重组的试剂如下表2：
[0107]表2同源重组的试剂
[0108]
[0109]
[0110]在冰上制备好上述体系后在37℃反应30分钟，得到重组产物。

[0111](3)将重组产物转化进DH5α感受态细胞。

[0112](a)在冰上解冻DH5α感受态细胞，取10μl重组产物加入到50μl DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。

[0113](b)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。

[0114](c)加入1ml SOC培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。

[0115](d)将AMP+的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。

[0116](e)取100μl的细菌液用无菌涂板棒轻轻涂在含有AMP+抗性的平板固体培养基上。

[0117](f)37℃培养箱中倒置培养12-16h。

[0118](4)菌落PCR进行筛选
[0119]用引物VP2-R/FDHN3-Smal-R1；正确产物为2858bp.
[0120]总共筛选24个单菌落，16呈阳性，具体可参考图5中单菌落筛选的图。

[0121](5)Btgzl酶切进行质粒鉴定。

[0122]分别取上述5个阳性菌落(1，2，4，5，6)进行扩增培养，提取质粒DNA。

分别用BtgzI (购自NEB)酶切，反应如下，反应所用试剂参考表3。

[0123]表3：质粒鉴定所用试剂
[0124]试剂用量
Buffer2μl
质粒DNA400ng
BtgzI1μl
ddH2O upto20μl
[0125]正确的质粒用Btgzl酶切后应分别产生1个10517bp，4376bp，3960bp，1816bp和288bp的DNA片段。

[0126]酶切结果如下图6，2号质粒产生了正确的5个片段。

[0127]将2号质粒进行测序验证，结果证明该质粒含正确的插入序列，命名为pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。

[0128] 2.转染BHK细胞,拯救病毒
[0129](1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNA Transfection Reagents转染试剂盒，并严格按试剂盒指导方法进行转染。

[0130](2)转染试剂配制如下：
[0131]A液：Opti-MEM Medium 150μl,Lipofectamine LTX Reagent 15μl,静置5min；[0132]B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl，吹打混匀，静置5min。

[0133]pXJ40-NP，pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3的制备可参考CN 201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书108-153段。

[0134]取A液B液各150μl混合均匀，静置20min。

取250μl混合液用于转染细胞。

[0135](3)4天后将上述转染细胞(包括培养液)置-80℃冻存。

[0136](4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃10000/rpm离心5分钟。

[0137]取200μl上清液感染BHK-21细胞,该上清液中含有病毒rDHN3mF-IBDVvp2。

[0138]48h后可见大量细胞死亡。

如下图7所示：A感染细胞；B未加病毒液的阴性对照细胞。

分别从A,B细胞提取总RNA用于下述病毒鉴定试验。

[0139] 3.鉴定重组病毒
[0140](1)RT-PCR
[0141]用上述A和B细胞总RNA进行RT-PCR。

[0142]RT:使用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(Takara 2641A)并严格按照
说明书进行。

[0143] A.Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，总量6μl。

配方如表4；[0144]表4：RNA/引物混合液配方
[0145]试剂名称使用量
模板RNA100ng
Random Primers(25μM)2μl
RNase free H2O Up to 20μL
[0146] B.70℃10分钟后迅速在冰上冷却2-3min。

[0147] C.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，配方如表5；
[0148]表5：反转录反应液配方
[0149]
[0150]置37℃，反应1小时。

[0151]PCR：分别用引物F-F(SEQ ID NO：14)/F-R(SEQ ID NO：15)和引物VP2-R/FDHN3-SmaI-R1进行。

[0152]PCR体系配方如表5；
[0153]表5PCR体系配表
[0154]
[0155]
[0156]PCR反应条件如下：
[0157]95℃3min、95℃30s、56℃30s、72℃1min/kb、72℃5min；
[0158]95℃30s、56℃30s、72℃1min/kb循环30次。

[0159]分别取10μl PCR产物跑胶，结果如图8所示：图8中1和3为A样的PCR产物，2和4为B
样的PCR产物。

1和2为第一对引物的PCR产物，正确应为844bp；3和4为第二对引物的PCR产物，正确应为2858bp；结果显示A样品产生了正确大小的PCR产物。

[0160](2)扩增病毒
[0161]用上述rDHN3mF-IBDVvp2 P0代病毒200μl接种SPF鸡胚并连续传代10次，收获各代鸡胚尿囊液于-800℃保存。

[0162](3)RT-PCR和测序验证rDHN3mF-IBDVvp2重组病毒的稳定性
[0163]分别从重组毒rDHN3mF-IBDVvp2的F1、F5、F10代鸡胚尿囊液中提取RNA并用其进行RT-PCR。

方法和前述一致。

[0164]PCR：引物为M-F(SEQ ID NO：12)/P-R(SEQ ID NO：13)；正确产物应为1985bp。

[0165]结果如下图9所示，3个样本均产生了正确大小的PCR产物。

将其分别送去测序，结果证实均为正确的DNA序列，提示该重组病毒是相对稳定的。

[0166] 4.WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白
[0167]用正常鸡胚尿囊液(1)，感染IBDV鸡胚尿囊液(2)和感染rDHN3mF-IBDVvp2尿囊液(3)跑12％蛋白胶并进行WB检测。

结果参考图10，显示如下：用抗IBDVvp2抗血清能检测到约40kD大小的蛋白，该蛋白在蛋白胶上显示与IBDV感染产物具相同的大小和形态。

[0168]用正常鸡胚尿囊液(1)，感染DHN3mF鸡胚尿囊液(2)和感染rDHN3mF-IBDVvp2尿囊液(3)跑12％蛋白胶并进行WB检测。

结果参考图11，结果显示如下：用抗DHN3mF抗血清能检测到约55kD大小的蛋白。

该蛋白与DHN3mF感染产物相似。

[0169]详细方法如下：
[0170]测IBDV-VP2：
[0171]将BHK-21细胞置6孔培养皿培养至90％，PBS洗两遍，分别加入2ml0.1％trypsin-DMEM孵育液，用2MOI IBDV鸡胚尿囊液，或2MOI rDHN3mF-IBDVvp2鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞。

阴性对照加200μl SPF鸡胚尿囊液。

24h后收集细胞，加入300μl的2×SDS裂解液和30μl 的1M DTT，95℃沸水裂解10min后，12000×g离心10min，取上清10μl进行12％SDS-PAGE (Bio-Rad)。

后将蛋白电转移到NC膜上(Ameresco)。

5％脱脂乳封闭过夜，TBST(0.05％Tween20)洗涤四次，每次5min。

加入1﹕1000倍稀释的IBDV-VP2单抗室温孵育1h。

TBST洗涤四次，每次5min。

加1﹕10000倍TBST稀释的二抗IRDye 680RD Goat anti-Mouse(926-68070)，室温孵育1h。

TBST洗涤四次，每次5min。

用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像。

[0172]测NDV蛋白
[0173]将BHK-21细胞置6孔培养皿培养至90％，PBS洗两遍，分别加入2ml0.1％trypsin-DMEM孵育液，用2MOI DHN3鸡胚尿囊液，或2MOI rDHN3mF-IBDVvp2鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞。

阴性对照加200μl SPF鸡胚尿囊液。

24h后收集细胞，加入300μl的2×SDS裂解液和30μl 的1M DTT，95℃沸水裂解10min后，12 000×g离心10min，取上清10μl进行12％SDS-PAGE (Bio-Rad)。

后将蛋白电转移到NC膜上。

5％脱脂乳封闭过夜，TBST(0.05％Tween20)洗涤四次，每次5min。

加入1﹕1000稀释的NDV阳性血清室温孵育1h。

TBST洗涤四次，每次5min。

加1﹕10000倍TBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡Ig G(LIC)室温孵育1h。

TBST洗涤四次，每次5min。

加入超敏ECL化学发光显色液。

用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像。

[0174]四.结论
[0175]我们将传染性法氏囊病毒IBDVLYZS株的VP2基因通过DNA重组的方法插进新城疫基因VII型DHN3-mF弱毒株的M和P基因之间，构建了一株感染性cDNA克隆pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。

将该克隆cDNA与pXJ40-NP，pXJ40-P，pXJ40-L，pXJ40-DE3共转染BHK-21细胞，成功获得一株稳定的能高效表达IBDVVP2和NDV抗原蛋白的重组病毒rDHNmF-IBDVvp2。

该病毒有望进一步开发成抗IBDV和抗NDV的二联疫苗，为控制鸡传染性法氏囊病和新城疫提供新的防御方法。

序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15192
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
accaaacaga gaatccgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60 tagaaggtgt gaaccccgaa cgcgagatcg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccga 120 tatgtcgtct gtttttgacg aatacgagca gctccttgct gcccagaccc gccctaacgg 180 agcccatgga gggggagaga aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240 aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ctttgcggta ttctgtcttc ggattgccgt 300 tagtgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360 ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaacgagg ccacactagc 420 tgttcttgag atcgatggtt ttgctaataa tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480 gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aattgcaggg tctctccctc gggcatgcag 540 caacggtact ccgtttgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600 cactctggaa aggatcctat ctgtccaagt ccaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660 gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720 gggtagagtc cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcat 780 aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctggttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840 tacagcaggt gggagctcta catattacaa tttggtcggg gatgtagact catacatcag 900 aaataccggg cttactgcgt ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960 agctctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020 atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080 gagctttgcg ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcagt 1140 cttagataag ggaactggca agtaccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200 gcgacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagt atcaatgaag acatggctgc 1260 tgagttaaaa ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320 tgaagaaatc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagca ggagtcctca ccgggctcag 1380 tgacgaaggc ccccgaactc cacagggtgg atcgaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440 tggggatggg gagacccaat tcctggattt tatgagaaca gtggcgaaca gcatgcggga 1500 atcgcctaat cctgcacaga gcaccactca tctagagcct cccccgaccc ctggggcatc 1560 ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactact cccagcctgc ctccatagga 1620 ccacaccaaa cccctccccc aaaacccccc cacacccccc gacccacaac cccgcacgac 1680
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