花椒籽油青睐型脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件的研究

花椒籽油青睐型脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
王琰;张志敏;王斌;陈斌;何玉婷;万一;马晓迅
【摘要】[Objective ] The strains with transesterification activity to Chinese prickly ash seed oil were screened. [ Method ] Strains with transesterification activity were screened from 11 methyl-resistant lipase-producing strains, which have been isolated by previous research in our laboratory. And the optimum enzyme producing conditions were optimized. [ Result ] In 11 strains, the conversions of Chinese prickly ash seed oil catalyzed by D-l-4 lipase was up to 43.05% , and the optimum culture conditions were as follows; 2.5% sucrose as carbon source, 2.0% soy bean power +1.0% corn power as compound nitrogen sources, adding 1.0% olive oil to the culture medium, initial Ph 6.0, incubated at 30 1] for 24 h ,the lipase activity reached 79.30 U/ml. [ Conclusion] All those provided basis for the application of lipase and lipaseproducing strains.%[目的]筛选对花椒籽油具有偏好性的脂肪酶产生菌.[方法]采用甘油法和气相色谱相结合的方法,从实验室分离到的11株具有甲醇耐受性脂肪酶菌株中筛选对花椒籽油具有转酯活性的菌株,并进行了最佳产酶条件的优化.[结果]11株菌株中以D-1-4菌脂肪酶催化花椒籽油的转酯率最高,达到43.05％;其最佳产酶条件为:以2.5％蔗糖为碳源、2.0％黄豆粉+1.0％玉米粉为复合氮源、1.0％橄榄油为诱导物,在初始pH6.0、30℃培养48h时脂肪酶活力达到79.30 U/ml.[结论]为脂肪酶产生菌及其脂肪酶的应用提供了依据.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)021
【总页数】4页(P12805-12808)
【关键词】脂肪酶;筛选;花椒籽油;转酯活性:培养条件
【作者】王琰;张志敏;王斌;陈斌;何玉婷;万一;马晓迅
【作者单位】陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省资源化工应用工程技术研究中心,陕西西安710069;陕西省资源化工应用工程技术研究中心,陕西西安710069;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省资源化工应用工程技术研究中心,陕西西安710069
【正文语种】中文
【中图分类】X712
脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），又称三酰基甘油酰基水解酶，能够在油水界面催化天然油脂的水解反应，同时对醇解、氨解、酯合成、酯交换及油脂的逆向合成反应起作用。

目前脂肪酶被广泛应用于洗涤业、油脂改良、食品加工、医药、造纸、新能源开发等领域，是一种有极大开发价值和应用前景的工业用酶［1］。

脂肪酶作为生物催化剂因其高效、反应条件温和、无毒等优点，引起了国内外学者的广泛关注。

目前，关于脂肪酶产生菌的筛选和基因工程菌的构建已有大量研究，国外学者已研究了Pseudomonas fluorescens和Penicillum camembeilii等菌株脂肪酶的结构和作用位置特异性［2］;成功克隆了多种脂肪酶基因，并将高产菌株如米赫毛霉（Mueormiehe）等菌株的脂肪酶基因克隆到适合发酵的菌株中［3］，大
大提高了脂肪酶产量，目前脂肪酶已大量应用于工业化生产。

在生物柴油研究中，脂肪酶作为生物催化剂也受到了广泛关注。

目前，日本在脂肪酶催化合成生物柴油中已实现产业化生产。

丹麦诺维信酶制剂公司的脂肪酶处于国际领先地位，2009年该公司得到300万美元资助，进行生物柴油专用型脂肪酶制剂的研发。

国内在酶法制备生物柴油方面也进行了研究，如清华大学刘德华教授课题组将商品化的Nov 435脂肪酶和自制Lipozyme TL IM脂肪酶联合催化制备生物柴油，转酯率达到90%，反应批次达到100次，目前已申请了多项专利［4］。

北京化工大学谭天伟教授课题组也开展了相关工作，并获得一定成果，目前正在进行中试试验［5］。

尽管脂肪酶在生物柴油研究中具有很好的应用前景，但目前尚存在脂肪酶对甲醇的耐受性差和成本高等问题。

为此，笔者以11株耐甲醇脂肪酶产生菌为研究对象，筛选对花椒籽油具有偏好性的脂肪酶产生菌，并对其产酶条件进行了研究，以期为脂肪酶产生菌及其脂肪酶的应用奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株。

以陕西省微生物研究所保存的11株耐甲醇脂肪酶产生菌为研究对象。

1.1.2 主要试剂与仪器。

十三碳酸甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯标品均购自ACROSORGANICS公司;三丁酸甘油酯购自上
海晶纯实业公司;花椒籽油为毛油;橄榄油、菜籽油、大豆油、调和油、玉米油等购
自西安华润万家超市;其他试剂均为国产分析纯。

SP－3420气相色谱仪购自北京
北分瑞利仪器有限公司;TGL－16C高速离心机购自江苏常州国华电器公司。

1.1.3 培养基。

种子培养基、发酵培养基均参考文献［6］。

1.2 方法
1.2.1 花椒籽油降酸处理。

将花椒籽油通过甲醇萃取、碱炼中和、蒸馏精炼和活性土脱色处理后供后续试验用。

酸值测定参考 GB/T5530－2005。

1.2.2 菌株的培养。

将保存的11株耐甲醇脂肪酶产生菌按1%的接种量接种于YPD种子培养基中，30℃、150 r/min培养过夜，再按2%的接种量转接于发酵
培养基中，30℃、150 r/min培养48 h，待用。

1.2.3 菌株的初筛。

将“1.2.2”中菌株的发酵培养液12 000 r/min离心10 min，收集发酵液上清;向上清液中加入研磨成粉末的硫酸铵至20%饱和度，4℃过夜，4℃、12 000 r/min离心20 min;弃沉淀，收集上清，向上清液中加入硫酸铵粉末至70%饱和度，收集沉淀;用去离子水溶解沉淀，透析处理后冷冻干燥，所得粉末即为脂肪酶粗品。

将获得的脂肪酶粗品分别催化大豆油、花生油、菜籽油和花椒籽油的转酯反应，测定转酯反应生成生物柴油中甘油的含量［7］。

甘油含量计算公式=（V1－V2）×C×0.092 1×100/m，其中V1为测定样品所消耗NaOH标准溶液的体积（ml）;V2为空白试验所消耗NaOH标准溶液的体积（ml）;m为试验
份的质量（g）;C为所用NaOH标准溶液的浓度（mol/L）;0.092 1为甘油毫摩尔质量（mol/L）。

比较脂肪酶催化4种油脂转酯反应中的甘油含量，其中对花椒籽油的转酯反应中甘油含量高的菌株即为目标菌株。

1.2.4 菌株的复筛。

将初筛菌株对花椒籽油的转酯反应产物以油酸甲酯为标准进行气相色谱分析［8］。

气相色谱分析条件为:SP－3420色谱仪，KB－1毛细管柱，FID检测器，以十三碳酸甲酯为内标，载气为N2，柱压0.1 MPa，气体流速为氢气30 ml/min，空气 300 ml/min，氮气 25 ml/min。

采用程序升温，即初温120℃保持1 min后，以10℃/min升温至280℃，维持5 min;进样口温度290℃，检测器温度300℃，进样量为0.3 μl［9］。

测定其转化为油酸甲酯的含量，并计算其转酯率。

转酯率=酶反应所得油酸甲酯的量/花椒籽油中油酸完全甲
酯化后所得油酸甲酯的总量×100%。

1.2.5 最佳产酶条件的优化。

于250 ml三角瓶中加入40 ml培养基，摇床转速150 r/min，培养温度30℃，培养周期48 h。

以控制变量法优化产酶条件。

1.2.6 脂肪酶活性的测定。

采用橄榄油乳化液水解滴定法，操作步骤参考
GB/T23536－2009。

2 结果与分析
2.1 花椒籽油的降酸花椒籽油毛油酸值高，易发生皂化反应，导致催化剂量减少和大量副产物生成。

因此，必须将其中的游离脂肪酸含量降低到一定水平。

通过甲醇萃取、碱炼中和、蒸馏精炼和活性土脱色处理等步骤将花椒籽油的酸值从毛油的62.832降至合成生物柴油反应的1.375，达到了生产生物柴油的条件。

2.2 对花椒籽油具有转酯活性脂肪酶菌株的筛选
2.2.1 初筛结果。

采用甘油法测定11株耐甲醇菌株所产脂肪酶对4种不同油脂底物催化合成生物柴油中生成的总甘油含量，间接反映脂肪酶催化合成生物柴油的转酯率。

结果表明，L－049、L－107、D－1－4、X－3－1 菌所产脂肪酶对花椒籽油的转酯活性高于其他3种油脂（表1）。

表1 脂肪酶催化不同油脂反应中总甘油含量的测定结果Table 1 The determination results of total glycerin content in different oils reactions catalyzed by lipases %油脂种类Kinds of oils 5 X－1－6 X－2－4 X－3－1大豆油Soybean oil 26.30 25.90 20.80 29.20 28.70 27.5菌株Bacterial strains L－003 L－011 L－035 L－049 L－107 D－1－2 D－1－4 D－2－0 37.50 18.60 19.90 23.50 19.90花生油Arachis oil 29.50 26.80 21.50 20.80 30.00 22.50 32.50 16.70 20.80 21.40 21.30菜籽油Rap oil 25.50 29.30 23.50 25.60 29.50 28.60 30.00 19.30 21.60 22.10 26.80花椒籽油Prickly ash seed oil 28.00 17.40 22.40 32.50 30.20 26.40 42.50 18.60 20.90 20.50 35.70
2.2.2 复筛结果。

进一步对初筛获得的对花椒籽油有较高转酯活性的4种脂肪酶的转酯产物进行气相色谱分析，且以花椒籽油中含量最高的油酸转化为油酸甲酯的量
为标准，测定不同脂肪酶的转酯活性。

结果表明，L－049、L－107、D－1－4、
X－3－1菌的转酯率分别为 30.80%、28.50%、43.05% 和32.80%，其中D－1
－4脂肪酶催化合成生物柴油的气相色谱如图1所示。

图1 D-1-4脂肪酶催化合成生物柴油的气相色谱Fig.1 Gas chromatogram of biodiesel catalyzed and synthesized by D-1-4 lipase注:A.溶剂峰;B.内标物（十三碳酸甲酯）;C～G.花椒籽油生物柴油主要组分，其中F为油酸甲酯。

Note:A.Solvent peak;B.Inner standard（Tricosanoic Acid Methyl）;C－G are the main components of Chinese prickly ash seed oil biodiesel，hereinto，
F is the methyl oleate.
2.3 最佳产酶条件的优化
2.3.1 碳源对脂肪酶活力的影响。

以发酵培养基为基础，改变碳源种类，研究多糖、双糖、单糖以及NaHCO3等不同碳源对菌株产酶的影响。

结果表明，当加入量均为2.0%（M/V）时，以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、NaHCO3为碳源的
培养基中的脂肪酶活力分别为14.80、10.50、17.20、12.80和14.50 U/ml，可见，蔗糖作为碳源效果最好。

经进一步研究发现，当蔗糖加入量为2.5%时最佳。

在碳源总加入量为2.5%的条件下，研究了蔗糖与可溶性淀粉或NaHCO3作为复
合碳源的影响，结果发现蔗糖与可溶性淀粉或NaHCO3的复合使用效果不如蔗糖单独作为碳源的效果好。

因此，以2.5%的蔗糖作为碳源。

2.3.2 氮源对脂肪酶活力的影响。

2.3.2.1 单一氮源对脂肪酶活力的影响。

以发酵培养基为基础，保持最佳碳源，研究蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、玉米粉和硫酸铵不同氮源对产酶的影响。

结果发现，当加入量均为3.0%（M/V）时，以蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、玉米粉、硫酸铵为氮源的培养基中的脂肪酶活力分别为18.80、16.70、19.50、15.80和9.30 U/ml，可见蛋白胨、酵母粉和黄豆粉为碳源时均能获得较高的脂肪酶活性，但是从成本角
度分析，以添加3.0%黄豆粉效果最佳。

2.3.2.2 复合氮源对脂肪酶活力的影响。

摇瓶试验认为氮源对酶产量影响大，复合氮源优于单一氮源。

一般地，复合氮源能为微生物提供充足的营养，对微生物的生长有利［10］。

因此，进行了有机氮源复合以及有机氮源与无机氮源复合试验。

结果表明，几种有机氮源和硫酸铵复合效果不大，其脂肪酶活力最高仅为21.70
U/ml;而有机氮源之间的组合可获得较高的酶活其中以2.0%黄豆粉+1.0%玉米粉
为氮源的脂肪酶活力最高（53.30 U/ml），2.0%黄豆粉+1.0%酶母粉次之（33.30 U/ml），1.0%黄豆粉+2.0%玉米粉（25.80 U/ml）和2.0%黄豆粉+1.0%蛋白胨（23.30 U/ml）再次之。

因此，采用2.0%黄豆粉+1.0%玉米粉作为复合氮源。

2.3.3 培养基起始pH对产酶的影响。

以筛选出的培养基为基础，研究初始pH在4～9时对产酶的影响。

由图2可知，培养基初始pH为6时产酶最高，故培养基的初始pH采用6。

图2 初始pH对产酶的影响Fig.2 Effect of initial pH on lipase activity
2.3.4 Mg2+浓度对产酶的影响。

研究发现，Mg2+对多种脂肪酶有较强的激活作用［11－13］。

因此，对Mg2+加入量进行了研究，结果发现Mg2+为0.05%时产酶活力最高（表2）。

表2 不同Mg2+浓度对产酶的影响Table 2 Effect of different concentrations of Mg2+on lipase activityMg2+浓度Mg2+concentration∥%酶活Lipase activity∥U/ml增长率Growth rate∥%0 13.30 －0.05 46.70 250.11 0.10 31.70 138.34 0.20 15.00 12.70 0.30 26.70 100.75
2.3.5 不同装液量对产酶的影响。

在250 ml三角瓶中分别装入不同量的发酵培养基，调pH 6，30℃摇瓶发酵48 h，研究不同装液量对产酶的影响。

结果发现当
装液量为30 ml时产酶能力最高（图3），故在后续试验中采用30 ml装液量。

2.3.6 不同接种量对产酶的影响。

在250 ml三角瓶中装入30 ml发酵培养基，调pH 6，30℃摇瓶发酵48 h，研究不同接种量对产酶的影响。

结果发现当接种量为2%时产酶能力最高（图4）。

2.3.7 不同油脂对产酶的影响。

脂肪酶的合成多数属于诱导型，油脂是合成脂肪酶的诱导物［14］。

在培养基中分别加入1.0%的橄榄油、菜籽油、玉米油、花生油、葵花籽油、调和油和花椒籽油，研究其产酶能力是否受到影响。

结果表明，D－1
－4菌株的产酶能力可被诱导，其中橄榄油有最好的促进作用，玉米油和花椒籽油也具有较强的促进作用（表3）。

图3 不同装液量对产酶的影响Fig.3 Effect of liquid medium volume on lipase activity
图4 不同接种量对产酶的影响Fig.4 Effect of inoculum size on lipase activity 表3 不同油脂对产酶的影响Table 3 Effect of different oils on lipase activity
油脂种类Types of oils酶活Lipase activity∥U/ml增长率Growth rate∥%无诱
导物Without inducer 43.50 －橄榄油Olive oil 79.30 82.29菜籽油Rap oil 55.00 26.44玉米油Maize oil 78.75 81.03花生油Arachis oil 42.50 －2.75
葵花籽油Sunflowerseed oil 72.50 66.67调和油Blend oil 45.00 3.45花椒籽油Prickly ash seed oil 76.30 75.40
3 讨论
（1）石化燃料对环境的污染以及能源的日益枯竭使生物柴油这种可再生绿色能源受到人们的广泛关注。

生物柴油具有可再生、可降解、环境友好、燃料性能良好等优良品性，可部分或全部替代石化柴油［15］。

目前合成生物柴油的主要工艺有
化学（酸或碱）催化法、生物酶催化法及超临界法等，其中以脂肪酶为催化剂的酶法制备生物柴油在节能环保方面具有其他方法无可比拟的优越性［16］。

但目前
酶法合成生物柴油的产业化程度并不高，尚存在原料油成本高、脂肪酶价格昂贵、
对有机溶剂易失活等问题［17］。

因此，利用廉价林业油料资源生产生物柴油以及寻找价格便宜、活性高、稳定性好的脂肪酶是解决酶法制备生物柴油的关键。

（2）花椒（Zanthoxylum bungeagum Maxim）为芸香科灌木或小乔木，是一种生态经济型树种，在我国种植面积已达13.33万hm2。

花椒籽是花椒果皮生产中的主要副产物，含油量高达30%，出油率可达20%～25%。

花椒籽油色泽黑、酸值高、易结晶，有刺激气味，少食用［18］，价格低廉。

目前已有利用花椒籽油为原料，采用碱催化法经酯交换生产生物柴油的报道［19］，而以花椒籽油作为原料采用酶法制备生物柴油的研究少见报道。

该研究以花椒籽油为底物，从11株耐甲醇脂肪酶菌株出发，通过甘油法和气相色谱法共同检测，发现D－1－4菌株对花椒籽油的转酯活性最高，转酯率可达43.05%。

同时试验也验证了甘油法与气相色谱法在检测脂肪酶转酯活性方面呈相关性，甘油法与气相色谱法相比操作更简便、通用性更强，可能为后续试验提供借鉴。

（3）对D－1－4菌株发酵条件进行研究发现，以2.5%的蔗糖作为碳源，2.0%的黄豆粉+1.0%的玉米粉作为氮源，添加0.05%MgSO4·7H2O，初始 pH 6，三角瓶装液量30 ml，摇床转速150 r/min，30℃培养48 h时产酶活力最高，可达46.70 U/ml，在培养液中加入1.0%的橄榄油时产酶活力大幅提高，可达79.30 U/ml。

蔗糖作为碳源，以及黄豆粉和玉米粉作为复合氮源，培养基价格低廉，适合进行大规模生产。

D－1－4菌株为野生菌，适合作为出发菌进行后续研究。

通过物理诱变、基因工程菌构建、蛋白纯化等方法，迸一步提高其催化活性，从而更好地应用于生物柴油生产。

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