一种绞股蓝提取物及其制备治疗肿瘤药物的用途[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.06.26C N 103169725 A (21)申请号 201310033188.5
(22)申请日 2013.01.29
A61K 31/704(2006.01)
A61K 36/424(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
A61P 35/02(2006.01)
C12P 33/20(2006.01)
C12R 1/225(2006.01)
(71)申请人中央民族大学
地址100081 北京市海淀区中关村南大街
27号
(72)发明人朴香兰 刘慧敏
陈道金
(54)发明名称
一种绞股蓝提取物及其制备治疗肿瘤药物的
用途
(57)摘要
本发明涉及一种绞股蓝提取物及其制备抗癌
药物的用途，该提取物的制备方法是：取绞股蓝
乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件
进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干
燥，用8-10倍量(v/w ，mL/g)的80％乙醇超声提
取2-4次，每次20-40min 。

将发酵绞股蓝乙醇提
取液减压浓缩，干燥得到本发明所述的绞股蓝提
取物。

通过采用微生物转化的方法制备的绞股蓝
提取物中活性成分的含量明显提高。

(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书5页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书5页 附图2页(10)申请公布号CN 103169725 A
*CN103169725A*
1.一种绞股蓝提取物，其特征在于，所述的绞股蓝提取物中含有以下化合物：
所述的绞股蓝提取物的制备方法如下：
取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基30-80℃条件进行发酵1-10天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用3-12倍量(v/w，mL/g)的30％-95％乙醇超声提取1-5次，每次5-60min，将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

2.如权利要求1所述的绞股蓝提取物，其特征在于，所述的绞股蓝提取物的制备方法为：取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43-75℃条件进行发酵2-8天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用4-10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取1-4次，每次10-40min，将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

3.如权利要求1所述的绞股蓝提取物，其特征在于，所述的绞股蓝提取物的制备方法为：取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用8-10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取2-4次，每次20-40min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

4.如权利要求1所述的绞股蓝提取物，其特征在于，所述的绞股蓝提取物的制备方法为：在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取3次，每次30min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减 10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取3次，每次30min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

5.权利要求1所述的绞股蓝提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基30-80℃条件进行发酵1-10天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用3-12倍量(v/w，mL/g)的30％-95％乙醇超声提取1-5次，每次
5-60min，将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

6.权利要求1所述的绞股蓝提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43-75℃条件进行发酵2-8天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用4-10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取1-4次，每次10-40min，将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

7.权利要求1所述的绞股蓝提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：所述的绞股蓝提取物的制备方法为：取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用8-10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取2-4次，每次20-40min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

8.权利要求1所述的绞股蓝提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：所述的绞股蓝提取物的制备方法为：在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用10倍量(v/w，mL/g)的95％乙醇超声提取3次，每次30min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到绞股蓝提取物。

9.权利要求1-4任一项所述的绞股蓝提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自：肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌和白血病。

一种绞股蓝提取物及其制备治疗肿瘤药物的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种富含达木林A、达木林B、gypenoside L和gypenosideLI的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)提取物，该提取物的制备方法，以及该提取物和这4种皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术
[0002] 皂苷(saponin)是天然物质中一类重要的化学成分，具有多种生物活性和药理活性，如抗肿瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、增加免疫调节等[1]，因此含有皂苷类成分天然物质的应用很广。

绞股蓝和人参中都因富含达玛烷型皂苷表现出强的生物活性。

研究发现，皂苷中糖的数量以及取代位置不同时，其产生的生物活性也会大有不同。

如，3位和20位各连有两个糖的人参皂苷Rb1具有营养神经、保护心肌、改善记忆力、抗衰老、抗氧化、保用等作用[2-4]，而3位上只有一个糖的人参皂苷Rh2和3位连有两个糖的Rg3却具有良好地抗肿瘤活性[5，6]。

因此，对化合物进行合理的结构修饰可创造巨大的经济效益[7，8]。

目前利用生物转化方法获取生物活性强的皂苷的研究也是一个热点[9]。

[0003] 绞股蓝为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino的全草[10]，具有清热解毒，止咳祛痰等功能。

由
“第二人参”的美誉[11]。

于绞股蓝中含有与人参相似的达玛烷类皂苷，又被冠予“南方人参”、
[0004] 近年来，许多研究表明，人参属植物中抗癌活性与低极性、稀有或微量人参皂苷直接相关，如稀有人参皂苷Rh2、Rg3、Rb3等药效更为珍贵，在某些难治性疾病肿瘤治疗方面显示独特的疗效[12，13]。

但是在天然植物中人参皂苷Rb1含量较高，而Rg3、Rh2、Compand K 等含量甚微。

同样，绞股蓝中最主要的药效成分也是皂苷类成分。

绞股蓝中的gypenosidc L、gypenosideLI、达木林A及达木林B也具有抑制癌细胞增殖作用，但它们在绞股蓝中的含量甚微[14]，是强活性的稀有绞股蓝皂苷。

对于这些有较强活性的稀有皂苷来说，它们的来源有限而且在植物体内含量较低。

如果用传统方法进行分离，不但耗费大量的药用资源，而且得率也很低。

因此，如何提高稀有活性成分的含量或获得更有活性的成分已经成为现代药学研究的重点。

[0005] 利用微生物，对绞股蓝总提物进行成分转化。

发现微生物转化产物与原植物相比，具有更强的抗肿瘤活性。

利用微生物转化后得到更多强抗肿瘤活性的稀有绞股蓝皂苷，为寻找高效低毒的抗癌药提供了理论依据。

[0006] 参考文献：
[0007] [1]张存莉，吴战库，马惠玲，朱玮.甾体皂苷的生物活性研究进展[J].西北林学院学报、2003、18(2)：95-100.
[0008] [2]王立青，江荣高.人参皂苷Rb1的药理活性[J].国外医药(植物药分册)，2005，20(6)：245-248.
[0009] [3]贾继明，王宗权，吴立军，等.人参皂苷Rb1的药理活性研究进展[J].中国中药杂志，2008，33(12)：1371-1377.
[0010] [4]Ng TB.Pharmacological activity of sanchi ginseng(Panax notoginscng) [J].J Pharm Pharmacol，2006，58(8)：1007-1019.
[0011] [5]Cwikowska M，Pruchnik FP，Starosta R.Dinuclear Rh(II)complexes with one polypyridyl ligand，structure，properties and antitumor activity[J]. Inorganica Chimica Acta，2010，363(11)：2401-2408.
[0012] [6]Zhang Q，Kang X，Zhao W.Antiangiogenic effect of low-dose cyclophosphamidc combined with ginsenoside Rg3on Lewis lung carcinoma[J]. Biochemical and Biophysical Researeh Communications，2006，342(3)：824-828. [0013] [7]Lee YJ，Kim HY，Kang KS，et al.The chemical and hydroxyl radical scavenging activity changes of ginsenoside-Rb1by heat processing[J].Bioorg Med Chem Lctt，2008，18(16)：4515-4520.
[0014] [8]Lee WH，Choi JS，Kim HY，et al.Heat-processed neoginseng，KG-135，down-rcgulatesGl Cyclin-dependent kinasc through the proteasome-mediated pathway inHcLa cclls[J].Oncol Rep，2009，21(2)：467-474.
[0015] [9]赵方允，陈自宏，虞泓，等.微生物转化人参皂苷研究进展[J].中国医药生物技术，2010.5(3)：216-219.
[0016] [10]梁启成，钟鸣，中国状药学[M]，广西民族出版社，2005.
[0017] [11]张涛，袁弟顺.中国绞股蓝种质资源研究进展[J].云南农业大学学报，2009，24(3)：459-469.
[0018] [12]李学哲，朴惠顺.人参皂苷Rh2含量测定方法及药理作用研究现状[J].延边大学医学学报，2009，32(2)：153-156.
[0019] [13]Wang CZ，Xie JT，Fishbein A，et al.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng on SW480human colorectal cancer cells[J].Phytother Res，2009，23(1)：6-13.
[0020] [14]吴倩.绞股蓝热处理产物抗NSCLC A549细胞有效成分研究[D].北京：中央民族大学2012.
发明内容
[0021] 本发明的目的在于提出一种富含达木林A(damulin A)、达木林B(damulan B)、gypenoside L和gypenoside LI的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)提取物，该提取物的制备方法，以及该提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。

通过采用微生物转化的方法制备的绞股蓝提取物中活性成分的含量明显提高。

进而提高了本发明的绞股蓝提取物治疗肿瘤的效果。

[0022] 本发明的绞股蓝提取物中含有以下化合物：
[0023]
[0024] 本发明的绞股蓝提取物的制备方法如下：
[0025] 取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基30-80℃条件进行发酵1-10天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用3-12倍量(v/w，mL/g)的30％-95％乙醇超声提取1-5次，每次5-60min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到本发明所述的绞股蓝提取物。

[0026] 优选的制备方法如下：
[0027] 取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43-75℃条件进行发酵2-8天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用4-10倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇超声提取1-4次，每次10-40min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到本发明所述的绞股蓝提取物。

[0028] 进一步优选的制备方法如下：
[0029] 取绞股蓝乙醇提取物，在保加利亚乳杆菌培养基43℃条件进行发酵6天，将发酵后的绞股蓝总提物冷冻干燥，用8-10倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇超声提取2-4次，每次20-40min。

将发酵绞股蓝乙醇提取液减压浓缩，干燥得到本发明所述的绞股蓝提取物。

[0030] 本发明通过运用LCMS-IT-TOF技术手段，根据文献，鉴定了所制备的绞股蓝提取物中的4个有效成分：达木林A(damulin A)、达木林B(damulan B)、gypenoside L和gypenoside LI。

并利用HPLC-MS分析方法，对该提取物中的各有效成分进行了含量变化分析。

其中：
[0031] 所述的化合物通过保加利亚乳杆菌发酵，含量均显著提高。

[0032] 所述绞股蓝提取物中有效成分的分离及鉴定如下：
[0033] 用2倍树脂床体积(2BV)的乙醇，以2BV/h的流速通过HP-20大孔树脂层，并保持
液面高度，浸泡过夜。

用乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为
止。

取乙醇洗脱液适量，在200-400nm范围内扫描紫外图谱，在250nm左右无明显紫外吸收。

用去离子水以2BV/h的流速通过树脂层，洗净乙醇。

用2BV4％的HCl溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性(pH试纸检测pH ＝7)。

用2.5BV4％的NaOH溶液，以5BV/h的流速通过树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性(pH试纸检测pH＝7)。

[0034] 将绞股蓝提取物用水超声混悬倒入大孔树脂HP20中，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡、吸附过夜。

洗脱流速为2BV/h，分别用20％，50％，75％，95％乙醇醇溶液洗脱。

[0035] 上述95％乙醇洗脱液通过LCMS-IT-TOF技术手段，根据文献，最终被鉴定为绞股蓝皂苷gypenosdie L、gypenoside LI、达木林A、达木林B(图1、图2)。

[0036] 由于达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI对于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和白血病细胞均具有较强的抑制作用，因此在本发明中，我们还提供了本发明制备得到的绞股蓝提取物在制备治疗肿瘤药物中的用途。

附图说明
[0037] 图1绞股蓝醇提物在保加利亚乳杆菌发酵前(A)与发酵后(B)(本发明绞股蓝提取物)的负离子模式总离子图谱
[0038] 图2绞股蓝提取物中的皂苷类化合物达木林A(A)、达木林B(B)、gypenosidc L(C)、gypenoside LI(D)的LC-MS图谱
具体实施方式
[0039] 实施例1提取物的制备实验
[0040] 我们比较了几种不同的制备方法制备得到的提取物，并测定了其中达木林A、达木林B、 gypenoside L、gypenoside LI四个化合物的含量。

结果如下：
[0041] 1、发酵前绞股蓝醇提物的制备
[0042] 取绞股蓝用8倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇回流提取3次，每次2h，浓缩，浓缩液在保加利亚乳杆菌培养基中，直接冷冻干燥，得到发酵前绞股蓝醇提物。

[0043] 2、绞股蓝醇提物的保加利亚乳杆菌发酵产物的制备(本发明制备的绞股蓝叶提取物)
[0044] 取绞股蓝用8倍量(v/w，mL/g)的80％乙醇回流提取3次，每次2h，浓缩，浓缩液在保加利亚乳杆菌培养基中，43℃发酵6天，冷冻干燥得到绞股蓝醇提物的发酵产物。

[0045] 利用HPLC-MS分析方法，对发酵前绞股蓝醇提物和绞股蓝醇提物的发酵产物进行含量比较。

[0046] 表1不同提取物中达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenosidc LI的峰面积变化
[0047]
[0048] 结果表明，如表1所示，绞股蓝醇提物的发酵产物(本发明制备的绞股蓝提物)中绞股蓝皂苷达木林A、达木林B、gypenoside L、gypenoside LI的含量提高。

经统计学分析，
该差异具有显著性，产生了预料不到的技术效果。

图1
图2。