嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用

加一定 蒸 馏 水 搅 拌 溶 解$分 装$于 5"5 c 高 温 灭 菌 "#U>;'在诱导目的菌种表达时$还应加入"d的已灭 菌!#i!#!"母液!"!d甘油$"^!d葡萄糖$5#d /I半 乳糖"'
58" 方法 58"85 目的基因的发掘与序列分析!!通过 .*a'基因 库从?H0>0-*3F*A0 X``HT#5中找到一段芳基硫酸 酯酶编码基因<@DJ.0-2T$使用 %NQER:在线网站预测该 序列的蛋白大小$使用 1>B;ED$!8#在线网站预测该序 列是否存在信号肽$使用 1`+&2 在线网站对该序列 翻译 的 蛋 白 可 能 存 在 的 结 构 域 进 行 预 测$使 用 2`I 4``16@S6@S8"8#在线网站预测该序列翻译的蛋白是 否存在跨膜结构域$使用 `%W+98#9 软件制作进化 树$使用?DAR<EDN软件对该基因序列进行多序列比对$ 并用 %1$@>Q<H8#在线网站将多序列比对结果输出' 58"8" 产芳基硫酸酯酶重组质粒的构建!!使用""59% 海水培养基培养?H0>0-*3F*A0 X``HT#5$利用试剂盒 提取菌株基因组'根据目的基因序列和Q%2I"YE!Z"质 粒图谱$分别设计上下游引物$如表5所示$分别以 ?H 0>0-*3F*A0 X``HT#5和 Q%2I"YE!Z"质粒为模板$ 用各自上下游引物进行目的基因和载体的 $*& 扩增 和同源臂的构建'
5!材料和方法
. All Rights Reserved.
585!试剂材料 58585 菌株及质粒!!嗜琼胶华美菌 X``HT#5购自 中国 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 !菌 株 编 号# 5^5"J"H"%大肠 杆 菌 !P2DF=-*DF*0D<A*")4!/&大 肠 杆 菌 a,"5!)%H"&表达载体 Q%2I"YE!Z"均购自北京天 根生化科技有限公司' 5858" 试剂!!X() 高保真酶购自日本东洋纺生物科 技有限公司%胶回收试剂盒 W6D%N<@E?<>C;X><!"##" 购自美国 (`%W+ 公司%$*&回收试剂盒 W6D%N<@E?I <>C;X><!"##"购自美国 (`%W+ 公司%2E]聚合酶混 合体系 "i2E]`ER<6@`>N购自诺唯赞生物科技有限 公司%快 速 质 粒 小 提 试 剂 盒 2'+.Q@6Q &EQ>M `>;> $DERU>MX><购自北京天根生化科技有限公司%).+ 标 准分子量 `E@L6@和蛋白质标准分子量 `E@L6@购自索 莱宝生物科 技 有 限 公 司%卡 那 霉 素 购 自 上 海 生 工 生 物 工程有限公司%琼脂粉购自福建绿新集团%其他试剂均 为国产分析纯' 5858H 培养基
表5!引物名称及序列 2E7D65!$@>U6@;EU6RE;MR6]A6;?6R
引物 $@>U6@
引物序列!!1-H1" $@>U6@R6]A6;?6!!1-H1"
-+&1I9-
2WWW2*W*WW+2**W++22*+2WI W*+**+W**W+W++++*
-+&1I9&
Q%2I"YEIQ%2I"YEI&
第!"卷!第"期!
! "#ŝ()'*+,(-(*%+. /.'0%&1'23 (-*4'.+
!"!""##!#!#!T -678$"#""
嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆 表达及在琼胶脱硫中的初步应用"
吴美娴5付晓婷5"" 刘!振5毛相朝5"
!58中国海洋大学食品科学与工程学院$山东 青岛 "99##H% "8青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋药物与生物制品功能实验室$山东 青岛 "99"HG"
嗜琼胶华美菌!?<-C<200>0-*3F*A0"X``HT#5可 高效降解琼胶$其基因组含多种蛋白酶及糖苷水解酶$ 其中糖苷水 解 酶 通 常 与 转 运 因 子&转 运 蛋 白 和 硫 酸 酯 酶共同形成 独 特 的 多 糖 利 用 位 点$这 说 明 硫 酸 酯 酶 对 于硫酸化海藻 多 糖 的 降 解 至 关 重 要)55*' 因 此$嗜 琼 胶 华美菌 X``HT#5中可能存在有重要价值的芳基硫酸 酯酶'
!5
为底物 时 的 酶 活 !H^TH /"仅 为 以 对 硝 基 苯 硫 酸 酯 !QI;><@CQ=6;:DRADFE<6$3.$1"为底物时酶活!TG^" /" 的Jd)5#*'到目前为止已报道的芳基硫酸酯酶对琼胶 的酶活都很低'因此$扩大芳基硫酸酯酶基因库$寻找 以琼胶为底物时酶活较高的芳基硫酸酯酶对推进酶法 进行琼胶的 高 效 脱 硫$将 酶 法 琼 胶 脱 硫 从 实 验 室 规 模 推向产业化$实 现 高 品 质 琼 胶 与 琼 脂 糖 的 规 模 化 生 产 具有重要意义'
!5",a培养基#用电子天平按比例称取 5d 蛋白 胨&5d .E*D&#^!d酵母粉$加一定蒸馏水搅拌溶解$ 分装$于5"5 c高温灭菌"#U>;$取出备用'
!""P3$I!#!"培养基#按比例称量#^"d 5 UCD(, `B1(J$#^!d 酵母粉$5d 蛋白胨$!d "#i$!5UCD(, .E"4$(J$5UCD(,X4"$(J$#^!UCD(, !.4J""1(J"$
收稿日期#"#"5I#5I5!%修订日期#"#"5I#!I#9 作者简介#吴美娴!5TT9+"$女$硕士生'%IUE>D#[AUN!Y#"59H8?CU !""!通讯作者#%IUE>D#N>EC<>;BFA"CA?86MA8?;
"期
吴美娴$等#嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用
脱硫的潜力$同时建立了利用该酶进行琼胶脱硫的催化体系'
关键词#!芳基硫酸酯酶%异源表达%酶学性质%琼胶 中图法分类号#!fY5J8T%21"#58"Z!!!!!!文献标志码#!+!!!!!文章编号#!59G"I!5GJ!"#"""#"I#!#I5# #!5#859JJ5(K8?;L>8=MN78"#"5##5G 引用格式#!吴美娴$付晓婷$刘振$等8嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用)O*8中国海 洋大学学报!自然科学版"$"#""$!"!""#!#I!T8
琼胶是红 藻 类 细 胞 壁 的 主 要 组 成 成 分$常 使 用 江 蓠&石花菜&紫菜等作为原料来进行生产'琼胶具有良 好的凝胶性及 稳 定 性$被 广 泛 应 用 于 食 品&医 药&科 学 等领域'琼胶 品 质 取 决 于 琼 胶 的 凝 胶 强 度$而 琼 胶 的 凝胶强度取 决 于 其 中 硫 酸 基 的 含 量$硫 酸 基 会 在 琼 胶 凝胶形成的 过 程 中 阻 碍 分 子 交 联$降 低 琼 胶 的 凝 胶 强 度$因此脱除硫酸基对改善琼胶品质具有重要意义)9*'
!!芳基硫酸酯酶!+@:DRADFE<ER6$%8*8H858985"是一类 断裂硫酸酯键&生成无机 硫 酸 盐 类&参 与 调 节 代 谢 的 酶$广泛分布于自然界&细菌&哺乳动物中$结构较为保 守)5*'目前已 报 道 的 芳 基 硫 酸 酯 酶 种 类 繁 多$如 来 源 于 92=@4<C<+020=-@>*+<20)"*&SA@'B=-<C'D=2A0DJ /*2)H*&?@20-*@C 3-<A*.=-0/@C ,%5)J*及来源于人的芳 基硫 酸 酯 酶)!*$其 在 土 壤 环 境 评 价&水 治 理&医 学 方 面 都有应用价值$具有较好的发展前景'
. eAAll`6>RN>Ei;g$h-tAsg>ECR<>e;Bs$e,r>AvPe=d6;.$6<ED8*DC;>;BE;M?=E@E?<6@>VE<>C;CFE;EDLED>;6E@:DRADFE<ER6B6;6F@CU?<-C<200>0J
-*3F*A0E;MEQQD>?E<>C;>;M6RADFE<>C;CFEBE@)O*8$6@>CM>?EDCF(?6E;/;>S6@R><:CF*=>;E$"#""$!"!""#!#I!T8
2*W+W2W*WW**W*++W*22+22+WI 2+2*++2**+**+2+
++W*22W*WW**W*+*2*W+W* W++22*WW+2**W*W+***+222W*2
$*& 结束后$用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离验 证$分别用 $*&回收试剂盒和胶回收试剂盒回收条带 大小正确的扩增目的基因和扩增载体'用无缝拼接试 剂盒连接目的基因和载体$构建重组质粒Q%2I"YE!Z"I (/*I-+&19$并采用 热 激 法$将 连 接 后 的 重 组 质 粒 转 入感受态细胞PHD<A*)4!/中$经抗性平板筛选后$进 行阳性克隆验证及相应的序列测序' 58"8H 产芳基硫酸酯酶重组质粒在PHD<A*a,"5)%H 中的表达!!用质粒提取试剂盒从测序结果正确的 PH D<A*)4!/中提取重组质粒$重 新 转 化 入 PHD<A*a,"5 !)%H"中$将转化成功的工程菌活化后$接种至 P3$I
! "!基金项目#山东省自然科学基金杰出青年基金项目!P&"#"#Of5!"%中央高校基本科研业务费专项!"#5TJ5##""资助 1AQQC@<6M7:<=6.E<A@ED1?>6;?6-CA;ME<>C;FC@)>R<>;BA>R=6M3CA;B1?=CDE@CF1=E;MC;B$@CS>;?6CF*=>;E!P&"#"#Of5!"%<=6-A;I MEU6;<ED&6R6E@?=-A;MRFC@<=6*6;<@ED/;>S6@R><>6R!"#5TJ5##""
本研究从嗜琼胶华美菌 X``HT#5基因组中发掘 出一段芳基 硫 酸 酯 酶 目 的 基 因$并 构 建 大 肠 杆 菌 工 程 菌用于异源 表 达 该 芳 基 硫 酸 酯 酶 片 段$对 表 达 的 芳 基 硫酸酯酶进 行 分 离 纯 化 和 酶 学 性 质 研 究$最 后 探 究 了 其在脱除琼胶上硫酸基中的应用'
摘!要#!芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能$并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基$提高凝胶强度$改善琼胶性能' 为了发掘能用于琼胶脱硫的新型芳基硫酸酯酶$本研究根据嗜琼胶华美菌!?<-C<200>0-*3F*A0"X``HT#5的基因组注释 信息$筛选出了一段芳基硫酸酯酶编码序列 (/*I-+&19$并在大肠杆菌中对其进行异源表达$研究该酶的酶学性质$初步 探究其在琼胶脱硫中的作用'研究表明$该酶的分子量大小为9HL)E$以对硝基苯硫酸酯!3.$1"为底物反应T#U>;时的 最适温度为J! c$最适Q4 为T^#'.EZ 和 XZ 对酶活有促进作用$大部分金属离子&1)1和 .E"%)2+ 都可抑制该酶酶 活'动力学结果显示$该酶的 SC 值为H"^9H'UCD(,$LUEN值为T^"!'UCD(!,3U>;"'将琼胶与该芳基硫酸酯酶共同孵 育后$琼胶内部空隙变小$呈现出较好的空间网状结构'本研究成功发掘了一个新型芳基硫酸酯酶$该酶具有应用于琼胶
目前工业上多采用碱处理法对琼胶上的硫酸基进行脱 除$但是碱处 理 法 存 在 反 应 条 件 剧 烈&琼 脂 糖 产 率 低& 制备出的产品琼胶色泽差$环境污染严重等问题)G*'
芳基硫酸酯酶的反应机制可应用于脱除琼胶中的 硫酸基$相较 于 碱 处 理 来 说 酶 法 脱 硫 的 反 应 条 件 更 加 温和&环境友好$此外芳基硫酸酯酶还可以脱除碱处理 法不能脱除的琼胶中琼脂糖前体 *J位上的硫酸基$用 于制备更高 价 值 的 产 品 如 低 电 渗 的 琼 脂 糖&色 谱 树 脂 等)Y*'eE;B等从 E0-*+<C<+02RQ8-eI5中分离纯化 得到的芳基 硫 酸 酯 酶$对 于 琼 胶 上 硫 酸 基 的 脱 除 率 为 YT895d)T*'X>U 等从G3F*+><C<+02RQ8+19HH#中分 离纯化得到的芳基硫酸酯酶对于琼胶上的硫酸基的脱 除效果可达 TG8Gd$这 是 目 前 报 道 的 酶 法 脱 除 琼 胶 硫 酸基的最高脱除率'然而$尽管来源于G3F*+><C<+02 RQ8+19HH#的芳基 硫 酸 酯 酶 脱 硫 率 很 高$但 其 以 琼 胶