分子对接、CRISPRCas9技术筛选并验证DNA ligase Ⅳ抑制剂

肖红卫.分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选并验证DNA ligase IV 抑制剂［J ］.湖北农业科学，2021，60（23）：177-180．
收稿日期：2021-07-12
基金项目：湖北省农业科技创新中心项目（2019-620-000-001-20）；湖北省农业科学院青年拔尖人才项目（Q2018020）；湖北省农业科学院领
军人才项目（L2018015）；国家自然科学基金项目（31772577）；湖南创新型省份建设专项（2019RS1068）；重点领域研发计划（2020WK2030）；重点实验室开放课题（KLAEMB-2020-01）；外国青年人才计划项目（QN20200127002）；中国科学院战略性先导科技专项（XDA24030204）
作者简介：肖红卫（1979-），男，江苏大丰人，副研究员，硕士，主要从事动物生物技术研究，（电话）159****4615（电子信箱）
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分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选
并验证DNA ligase IV 抑制剂
肖红卫
（动物胚胎工程与分子育种湖北重点实验室/湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉
430064）
摘要：为了筛选靶向DNA 连接酶IV 的抑制剂以实现更有效的基因定点插入，采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA 连接酶IV 的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。

筛选到与化合物库一致的nocodazole 、Fisetin 和Methylene blue 3个小分子化合物，通过用MSTN 基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase 荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞，并结合不同的小分子化合物处理。

结果表明，没有用小分子化合物处理时，萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ 修复，不能得
到大量有活性的萤火虫荧光素酶；经过小分子化合物处理，抑制了细胞内的NHEJ ，提高了HDR 效率，能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。

使用nocodazole 、Methylene blue 和Fisetin 处理后的萤火虫荧光素酶检测结果65256.3、53713和77058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果41905.3的1.6、1.3和1.8倍，是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果10120的6.4、5.3和7.6倍。

证明所用的筛选策略正确，所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligase IV 抑制活性的抑制剂，为后续研究奠定了基础。

关键词：DNA 连接酶IV ；抑制剂；荧火虫荧光素酶报告载体；CRISPR/Cas9；小分子化合物中图分类号：Q819
文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2021）23-0177-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2021.23.039
开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：
Discovery of DNA ligase IV inhibitor through a docking-based screening
and CRISPR/Cas9study
XIAO Hong-wei
（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding/Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research ，Hubei
Academy of Agricultural Sciences ，Wuhan 430064，China ）
Abstract ：In order to screen for inhibitors targeting DNA ligase IV to achieve more effective gene-directed insertion ，molecular dock⁃
ing technology was used to screen out small molecule compounds with similar effects to the inhibitor SCR7targeting DNA ligase IV in the previous study.In this study ，three small molecule compounds ，nocodazole ，Fisetin and Methylene blue ，which are consistent with the compounds stored in this unit ，were screened.By using the truncated Firefly Luciferase luciferase reporter vector by the T11site sequence of the MSTN gene and CRISPR/Cas9-gRNA-T11vector to co-transform cells ，combined with different small molecule compound treatments.The results showed that without treatment with small molecule compounds ，NHEJ repair occurs at the truncated position of firefly luciferase ，and a large amount of active firefly luciferase cannot be obtained ；after treatment with small molecule compounds ，the intracellular NHEJ is inhibited ，and the HDR efficiency was improved.A large amount of active firefly luciferase was obtained.The firefly luciferase test results after treatment with nocodazole ，Methylene blue and Fisetin were 65256.3，53713，and 77058.3，respectively ，which were 1.6，1.3and 1.8times of the firefly luciferase test result 41905.3after SCR7treatment.The re⁃sults of firefly luciferase after SCR7treatment were 6.4，5.3and 7.6times higher than 10120.The screening strategy used in this study is correct ，and the small molecule compounds selected are inhibitors with DNA ligase IV inhibitory activity ，laying the foundation for subsequent research.Key words ：DNA ligase IV ；inhibitor ；Firefly Luciferase reportor ；CRISPR/Cas9；small molecule compound
湖北农业科学2021年
分子对接技术可以有效地分析“蛋白-配体”的互作难题，正成为药物重新定位的有利工具。

而作为新近发展的基因工程技术，CRISPR/Cas9作为功能基因组学方法可以克服药物开发的限制。

如何联合使用这两个技术进行药物筛选还尚未见报道。

基因编辑技术可以很方便地在DNA链上产生DSB，并利用DNA修复中的NHEJ机制，在靶基因座位上产生突变；或者利用DNA修复中的HDR机制，把目的基因定点插入靶基因座位。

该技术克服了传统转基因技术的整合随机、遗传不稳定等缺陷，具有很大的应用前景。

尤其是在利用DNA修复中的HDR机制把目的基因定点插入靶基因座位的研究上，比如乳腺特异表达基因区、输卵管特异表达基因区或者血液白蛋白基因区，使畜牧业产生高附加值的蛋白［1］。

由于在DNA修复中NHEJ与HDR的竞争，导致HDR效率比较低，科学家们竞相筛选各种小分子化合物以期能够抑制NHEJ通路依赖的DNA 连接酶IV活性，从而提高DNA修复通路中的HDR 效率［1］。

本研究通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/ Cas9-gRNA-T11载体共转细胞，并根据分子对接的结果筛选与SCR7作用类似的小分子化合物，接着检测各个孔中Firefly Luciferase的量，没有用小分子化合物处理时，萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复，不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶；经过小分子化合物处理，抑制了细胞内的NHEJ，提高了HDR效率，能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。

以期筛选到DNA ligase IV的抑制剂，为下一步研究奠定基础。

1材料与方法
1.1试验设计
如图1所示，设计3个试验。

试验1：在萤火虫荧光素酶基因（Firefly Lucifer⁃ase）中插入终止信号以及克隆自MSTN基因上可以被gRNA识别的序列（以下命名为T11位点）以截断萤火虫荧光素酶基因。

用该载体在细胞上进行转染试验并对荧光素酶进行检测，此时，应该检测不到萤火虫荧光素酶。

试验2：把上述构建的荧光素酶报告载体与CRISPR/Cas9-T11gRNA载体进行混合转染，T11 gRNA引导Cas9蛋白切割萤火虫荧光素酶报告载体中截断萤火虫荧光素酶基因的终止信号后的T11序列以产生DNA断裂，并利用细胞自身的DNA ligase IV对CRISPR/Cas9引入的DNA断裂进行修复。

再对荧光素酶进行检测，此时检测到的萤火虫荧光素酶的量与正常状态下的DNA修复关联，反映了单位时间内NHEJ依赖的DNA ligase IV 的活力。

Truncated Firefly
Luciferase Stop Codon-T11
Truncated Firefly
Luciferase
Truncated Firefly
Luciferase
Truncated Firefly
Luciferase
Stop Codon-T11
gRNA
SpCas9
SSA
NHEJ HDR
NHEJ
HDR
Firefly Luciferase Firefly Luciferase
inhibitor
图1试验设计
试验3：萤火虫荧光素酶报告载体与CRISPR/ Cas9-T11gRNA载体进行混合转染后，在细胞培养基中添加筛选出来的小分子化合物，再对荧光素酶进行检测，此时检测到的萤火虫荧光素酶的量与受抑制条件下的DNA修复关联，反映了单位时间内受抑制条件下NHEJ依赖的DNA ligase IV的活力。

通过3个试验，验证所筛选出的小分子对DNA 连接酶IV的抑制作用。

1.2Firefly Luciferase报告载体的设计
试验中所用的载体来自Akhtar Ali博士，得到毕延震的授权使用。

根据北京唯尚立德生物科技有限公司VK002SSA活性报道质粒构建试剂盒说明书，在萤火虫荧光素酶的中间插入终止序列以及MSTN 基因中的能被gRNA（GGCUGUGUAAUGCAUGUA UG）识别的位点序列（GGCTGTGTAATGCATGTAT⁃GTGG，本研究团队内部命名为T11位点）。

如图2所示。

Truncated Firefly Luciferase
MSTN T11gRNA:GGCTGTGTAATGCATGTATG MSTN T11site:CAAACACCGGCTGTGTAATGCATGTATGTGGTTTT
Stop MSTN T11
图2萤火虫荧光素酶报告载体
1.3CRISPR/Cas9载体设计
pX330-hSpCas9载体购自Addgene，将图2中的MSTN T11gRNA克隆进pX330-hSpCas9载体U6启动子后面。

1.4抑制剂的虚拟筛选
在本研究中，结合了基于对接的虚拟筛选方法，从前期建立的数据库中筛选DNA ligase IV小分子
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第23期抑制剂。

已知SCR7对DNA ligase IV 有抑制作用，因此在本研究中仅需寻找类似SCR7的能够与DNA ligase IV 结合的小分子化合物。

筛选小分子化合物的策略如图3所示。

Private-Built
Chemical database with ACD ChemSketch
DNA ligase IV
structure
a class of DNA ligase IV
inhibitor
3hit
Docking with Accelrys Discovery Studio
Constrainted by Compound library
图3基于虚拟筛选策略
采用ACD ChemSketch 软件建一个小分子化合物库，用Accelrys Discovery Studio 2.5软件进行虚拟筛选各个小分子与DNA ligase IV 的互作，并从中找出与SCR7作用类似的小分子化合物，结合实验室保存的各个小分子化合物，优选出SCR7、no⁃codazole 、Fisetin 和Methylene blue 4种小分子化合物进一步试验验证。

虚拟筛选结果如图4
所示。

SCR7
分子式SCR7与DNA ligase IV 对接结果
nocodazole 分子式nocodazole 与DNA ligase IV 对接结果
Fisetin 分子式
Fisetin 与DNA ligase IV 对接结果
Methylene blue 分子式
Methylene blue 与DNA ligase IV 对接结果
图4抑制剂的虚拟筛选结果
1.5
细胞培养
HEK-293细胞接种于96孔板（2×104个/孔），每
孔用DMEM+10%FBS 培养基500μL ，在5%CO 2和
95%空气、100%湿度的培养箱中培养，待细胞培养至70%的汇合度时，用Lipofectamine 3000转染试剂将萤火虫荧光素酶报告载体质粒、CRISPR/Cas9-T11质粒共转入HEK-293细胞。

转染6h 后再加入小分子化合物（终浓度为10μmol/L ［2］）处理24h 。

1.6
萤火虫荧光素酶检测
移去培养基上清，加入1×DPBS 清洗培养细胞，反复洗2次，去掉清洗液，加入裂解液，将培养板在室温下轻缓晃动15min 后把裂解液转移到检测离心管中。

取各个样品20μL 加入到1.5mL 离心管中，剩余样品保存到4℃备用。

在样品中加入10μL LAR Ⅱ溶液，在Promega Modulus™单管型多功能检测仪上检测Firefly Luciferase 。

试验重复3次。

2结果与分析
在本试验中，参考Li 等［2］所用的SCR7工作浓
度，取试验浓度的下限值，避免细胞周期的影响。

双荧光素酶检测结果如图5所示。

15000010000050000
双荧光素酶量B l a n k
S S A -L u c -S C R 7（-）
S S A -L u c -S C R 7（+）
1562-c h e m i c a l （-）
1562-S C R 7（+）
1562-n o c o d a z o l （+）
1562-M e t h y l e n e b l u e （+）
1562-F i s e t i n （+）
处理
图5筛选出的小分子化合物验证结果
图5用SSA-Luc 载体和CRISPR/Cas9载体混转
后，不加SCR7处理后的检测结果是116.7，添加SCR7处理后的检测结果是318。

用1562载体和CRISPR/Cas9载体混转后，不加SCR7处理后的检测
结果是10120，添加SCR7处理后的检测结果是
41905.3，添加SCR7后可以提高DNA 修复中的HDR 效率3.14倍。

用1562载体和CRISPR/Cas9载体混转后，依次使用nocodazol 、Methylene blue 和Fisetin 处理后的检测结果分别是65256.3、53713和77058.3。

结果显示，添加小分子化合物SCR7、no⁃codazole 、Fisetin 和Methylene blue 处理后，用Pro⁃
肖红卫：分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选并验证DNA ligase IV 抑制剂179
湖北农业科学2021年
mega Modulus™单管型多功能检测仪分别检测萤火虫荧光素酶的量，萤火虫荧光素酶的表达量均得到了提高，荧光素酶的量直观地反映了这类小分子化合物对DNA ligase IV的抑制作用，没有小分子化合物参与的情况下，荧光素酶的量接近于本底，结果证明经过小分子化合物处理后基因编辑的效率提高了，验证了本试验设计的的成功。

3讨论
CRISPR/Cas9产生的DSB被Ku70/Ku80异二聚体识别后，该异二聚体结合在DSB两侧的DNA末端，并活化DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的催化亚基。

DNA-PKcs与Ku70和Ku80以及DNA连接酶IV/XRCC4复合物一起完成对DSB的修复［3，4］。

作为NHEJ竞争通路的HDR在细胞内的效率很低（<5%），大部分DSB都由NHEJ修复完成，因此，科学家们大都从DNA ligase IV着手，从DNA ligase IV基因的转录产物着手，利用siRNA技术降低DNA ligase IV的表达量；或者从DNA ligase IV蛋白着手，利用抑制剂或者靶向降解药物降低DNA ligase IV的活性或者细胞内DNA ligase IV的量，以期降低NHEJ效率的同时提高HDR效率。

Song等［5］发现，NHEJ抑制剂SCR7可以提高2.3%的基因编辑效果。

Srivastava等［6］发现SCR7可以抑制DSB在无细胞修复系统中的连接。

Maruyama等［7］研究发现，SCR7的处理提高了HDR 介导的基因组编辑效率，在对多个基因进行检测时，使用SCR7处理最高可以提高基因编辑效率达19倍，并发现SCR7处理适用于具有足够保守的NHEJ 和HDR机制的非哺乳动物细胞。

Vartak等［8］也发现，SCR7通过抑制NHEJ显著提高了精确基因组编辑的效率，并且在体外和体内均有利于无错误的同源重组途径。

Chu等［9］使用了抑制剂SCR7将HDR 的效率提高了4~5倍。

Ma等［10］研究发现，与NHEJ 途径相比，CRISPR/Cas9介导的HDR指导的精确遗传修饰效率相对较低，通过添加SCR7来抑制DNA ligase IV从而抑制NHEJ，可以增加HDR介导的精确遗传修饰效率。

Hu等［11］研究发现，在使用ssODNs 作为模板时，与没有SCR7处理的细胞相比，SCR7处理使转染细胞中的靶向插入效率提高了3倍。

而Lin等［12］研究发现，将抑制剂SCR7引入CRISPR/ Cas9系统促进了HSV-1基因组中HDR介导的基因置换。

Li等［2］研究发现，小分子化合物SCR7、L755507和白藜芦醇可使猪胎儿成纤维细胞的HDR 效率提高2~3倍。

当用同源模板DNA和CRISPR/ Cas9质粒转染并用小分子处理时，具有大DNA片段
整合的敲入猪胎儿成纤维细胞系的比率可以达到筛
选细胞集落的50%以上，而用DMSO处理的细胞组
中敲入率为26.1%。

经过对接试验发现，在DNA li⁃gase IV上存在可以结合DNA以及SCR7分子的结构域，并推测可以利用该结构域通过虚拟对接技术来
筛选DNA ligase IV的抑制剂，筛选出来的小分子化
合物可以用于提高基因编辑效率的试验验证。

根据Li等［2］所用的小分子化合物与DNA ligase IV结合的区域进行筛选，把虚拟筛选结果结合自建小分子化合物库筛选出来nocodazole、Fisetin、Methy⁃lene blue等3个SCR7功能类似物。

经过验证，这3个小分子化合物均可以实现抑制DNA ligase IV活性的功能，为下一步研究奠定基础。

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