基因的克隆、表达载体构建与功能验证
测定基因功能的实验报告
一、实验背景基因是生物体内最基本的遗传单位，是生物体性状表达的遗传基础。
近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基因功能的研究成为生物科学领域的重要研究方向。
本研究旨在通过实验方法测定基因的功能，以期为基因编辑、基因治疗等生物技术提供理论依据。
二、实验目的1. 了解基因功能测定的一般原理和方法；2. 掌握基因功能测定的实验操作技能；3. 通过实验验证某一基因的功能。
三、实验材料1. 基因克隆载体：pET-28a（表达载体）；2. 基因片段：目的基因片段；3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、XhoI；4. DNA连接酶；5. 菌种：大肠杆菌DH5α；6. 试剂：LB培养基、氨苄西林、IPTG；7. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计等。
四、实验方法1. 基因克隆：将目的基因片段通过PCR扩增，然后用EcoRI和XhoI进行酶切，将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
2. 表达验证：挑取阳性克隆接种于LB培养基中，加入氨苄西林，37℃培养过夜。
次日，将菌液按1:100的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养至对数生长期。
加入IPTG诱导表达，分别在0、1、2、4、6小时取样，测定菌液的光密度（OD600）。
3. 功能验证：通过酶活实验、细胞实验等手段验证目的基因的功能。
五、实验结果1. 基因克隆：通过PCR扩增获得目的基因片段，酶切后与pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆。
2. 表达验证：在诱导表达后，菌液OD600值随时间推移逐渐增加，表明目的基因得到了有效表达。
3. 功能验证：通过酶活实验和细胞实验，验证了目的基因的功能。
六、实验讨论1. 本实验成功克隆了目的基因，并实现了其在大肠杆菌中的表达，为后续功能验证奠定了基础。
2. 在基因克隆过程中，需要注意酶切、连接、转化等操作步骤，确保实验的准确性。
3. 在表达验证过程中，通过测定菌液OD600值，可以初步判断目的基因的表达水平。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀，这可是个大话题啊！基因工程菌构建的方法和步骤，听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心，我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧，一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说，就是把一种生物体的基因提取出来，然后放到另一种生物体里，让它变得更强大、更有用。
这样一来，我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么，怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢？这可是个技术活儿，需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步：提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步：构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件，让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步：转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步：筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件，让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步：扩大培养规模。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。
这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。
2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。
表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。
3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。
这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。
4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。
5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。
这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。
6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。
这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。
7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。
例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。
克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。
这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。
分离目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。
通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。
二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。
实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。
2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。
3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。
4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。
四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。
2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。
（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。
（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。
3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。
（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。
4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。
（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。
（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。
五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。
2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。
大豆基因的克隆及表达载体的构成
大豆基因的克隆及表达载体的构成大豆（Glycine max）是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子中含有高蛋白、高油、高碳水化合物等营养成分，因此在全球范围内广泛种植和应用。
为了深入研究大豆的生长发育、代谢调控等基本生物学问题，以及开发新的大豆品种，需要对大豆基因进行克隆和表达研究。
下面我们来介绍大豆基因的克隆及表达载体的构成。
一、大豆基因的克隆大豆基因的克隆是指从大豆中分离出目标基因的过程。
大豆基因的克隆方法主要有PCR扩增、基因文库筛选和基因芯片等。
其中，PCR扩增是最常用的方法之一。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶链反应（PCR）技术，通过引物特异性扩增目标基因序列。
PCR扩增方法具有快速、简便、高效、灵敏等优点，适用于小片段基因的克隆。
而对于大片段基因的克隆，则需要使用基因文库筛选和基因芯片等方法。
二、大豆基因的表达载体的构成大豆基因的表达载体是指将目标基因插入到表达载体中，通过转化到宿主细胞中，使目标基因得以表达的载体。
大豆基因的表达载体构成主要包括以下几个部分：1.启动子：启动子是指调控基因转录的DNA序列，它位于基因的上游区域，与转录因子结合后启动基因的转录。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的启动子包括CaMV 35S启动子、nos启动子、ubi启动子等。
2.选择性标记基因：选择性标记基因是指在转化过程中，通过对宿主细胞进行筛选，选择带有表达载体的细胞的基因。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的选择性标记基因包括抗生素耐药基因、草酸乙酯酯化酶基因等。
3.多克隆位点：多克隆位点是指在表达载体中设置多个限制性内切酶切割位点，方便将目标基因插入到载体中。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的多克隆位点包括pUC19多克隆位点、pGEM-T多克隆位点等。
4.表达标签：表达标签是指将目标基因与特定的标签融合，以便于检测目标基因的表达情况。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的表达标签包括His标签、GST标签、FLAG标签等。
菌种构建的过程
菌种构建是一个涉及遗传工程和分子生物学技术的过程，旨在通过直接改变微生物的遗传物质来赋予或增强特定的生物学特性。
这一过程广泛应用于发酵工业、生物制药、环境治理、农业等领域。
以下是菌种构建的一般步骤：1. 目标基因的克隆与合成：- 首先需要确定所需赋予微生物的特性，比如抗性、特定代谢能力等，然后找到或合成相应的基因。
- 可以通过基因克隆技术从基因库中获取，或通过化学合成方法合成目标基因。
2. 基因表达载体的构建：- 将目标基因插入到表达载体中，这个载体通常是一个质粒或人工染色体，它能在宿主细胞中复制和表达目标基因。
- 表达载体设计时需考虑启动子、终止子、调控元件等因素，以确保基因的高效表达。
3. 转化：- 将构建好的表达载体转化到目标微生物中。
转化方法包括钙离子处理、电转化、脂质体介导转化等。
- 转化效率通过蓝白筛选等方法进行初步鉴定。
4. 转化子的筛选与验证：- 通过抗生素抗性或其他选择性标记来筛选成功转化的菌株。
- 通过PCR、DNA测序等分子生物学方法验证目标基因是否成功插入和表达。
5. 遗传稳定性分析：- 评估转化子在宿主细胞中的遗传稳定性，确保基因能够稳定传递给后代。
6. 生物特性评估：- 通过发酵试验、生物活性测试等方法，评估转化子是否获得了预期的生物学特性。
7. 优化与改良：- 根据评估结果对菌种进行进一步的优化和改良，可能涉及菌株的生理、代谢和生长条件的调整。
8. 大规模培养与应用：- 最终确定后，将菌种用于大规模生产或应用。
在整个菌种构建过程中，需要遵守相关的生物安全法规和指导原则，确保操作的安全性和环境的可持续性。
同时，科研人员和工程师还需要不断学习最新的科研进展和技术创新，以提高菌种构建的效率和成功率。
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容基因在大肠杆菌中的过表达实验是一种常用的实验方法，通过引入外源表达载体，将感兴趣的基因在大肠杆菌中过量表达，从而研究该基因在生物体中的功能、调控机制和相互作用等方面的问题。
本文将介绍基因在大肠杆菌中过表达实验的实验内容。
一、实验前的准备工作1.选择合适的表达载体：通常采用静态表达载体，如pUC19，pBluescript等，或动态表达载体，如pET系列，pGEX系列等。
2.克隆目标基因：使用PCR或其他克隆方法从原始样本中扩增出目标基因，并通过酶切与载体连接。
3.转化大肠杆菌：利用热激转化、电穿孔转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
二、基因克隆与构建表达载体1.通过PCR扩增基因：设计引物，利用PCR技术从模板DNA中扩增目标基因。
2.准备载体：选择适当的表达载体，并通过限制性内切酶酶切开，以便与PCR扩增的基因片段连接。
3.构建重组载体：将PCR扩增的目标基因片段与线性化的载体连接，利用连接酶如T4 DNA连接酶处理，并通过热激转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
三、大肠杆菌中的基因过表达1.筛选阳性克隆：将转化后的大肠杆菌克隆在含有适当抗生素的培养基上培养，选择阳性克隆并进行验证。
2.静态表达或动态表达：根据需要选择适当的表达载体和表达系统。
四、鉴定表达产物1.确定表达水平：通过聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，检测表达基因的存在和表达水平。
2.验证表达产物功能：通过下游分析，如活性酶测定、免疫组化、免疫印迹等方法，评估过表达产物的功能和活性。
五、研究过表达基因的功能和调控机制1.功能研究：通过过表达基因后的表型观察，如细胞生长、代谢物产量、酶活性增加等，评估基因表达对细胞生理过程的影响。
2.亚细胞定位：通过融合表达产物与荧光标记或标示剂相结合等方法，观察基因表达产物在细胞中的定位，从而推测其功能和组织定位。
基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤基因工程是指利用生物学技术对生物体的基因组进行人为操作，使其具备特定的性状或功能。
基本上，基因工程的步骤可以分为六个主要阶段：1.确定目标基因：在基因工程开始之前，需要先确定需要操作的目标基因。
这可以通过研究和了解生物的性状或功能来完成。
目标基因的选择通常是基于改善生物的其中一种属性，提高产量或抗病能力等。
2.基因克隆：基因克隆是基因工程的基本步骤之一，用于将目标基因从一个生物体中复制并放置到另一个生物体中。
这一步骤通常分为几个关键步骤：DNA提取、酶切、DNA连接和转化。
-DNA提取：从源生物体提取DNA，常用的方法是通过细胞裂解将DNA释放出来。
-酶切：用限制性内切酶切割DNA，生成特定的DNA片段。
-DNA连接：将目标基因与载体DNA连接，通常是通过DNA连接酶的作用。
-转化：将连接好的DNA导入宿主生物体中。
常用的转化方法包括化学法、电穿孔法和冲击法。
3.重组DNA的构建：一旦目标基因被克隆到载体中，可以通过多种方法进行DNA的重组构建，以进一步优化基因工程的效果。
这包括基因片段的串接、引入启动子或选择标记等。
4.基因表达：一旦重组DNA被构建完成，下一步就是将其表达出来。
这通常涉及将重组DNA导入宿主细胞中，并使用适当的启动子、增材剂和培养条件来促进基因的表达。
通常使用细菌、酵母、植物细胞或动物细胞等作为宿主。
5.选择性筛选：在基因表达后，筛选和选择性培养可以帮助确定哪些宿主细胞成功地表达了目标基因，并且可以通过对宿主细胞进行筛选和选择来鉴定这些细胞。
6. 验证和分析：一旦基因工程完成，需要将其验证和分析，以确保达到预期的结果。
这可以通过PCR分析、Southern印迹等方法来检测目标基因的存在和表达。
需要注意的是，这只是基因工程的基本步骤，实际操作可能有所不同。
此外，随着技术的不断发展，基因工程领域正在不断创新和进步，可能会有新的方法和技术被应用，以提高基因工程的效率和精度。
猪TRIM32_分子的克隆、表达及其功能分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报猪TRIM32分子的克隆、表达及其功能分析摘 要：TRIM32作为TRIM 家族中的一员，在宿主先天性免疫防御中起着重要的作用。
然而，现今对猪TRIM32分子的研究鲜有报道。
首先，利用RT-PCR 从猪肺中扩增获得了猪TRIM32分子，并将其克隆入真核表达载体p3xFlag-CMV-14，构建重组真核表达载体pFlag-porTRIM32。
随后，在Marc145细胞上利用过表达猪TRIM32，鉴定其在PRRSV 感染中的作用。
此外，为了进一步验证其在PRRSV 感染中的作用，在沉默Marc145细胞中内源性TRIM32表达的情况下，检测了PRRSV 的感染情况。
结果显示：成功构建了pFlag-porTRIM32真核表达载体；Western blot 的结果显示，Flag 抗体能识别瞬时表达的融合蛋白Flag-porTRIM32；在Marc145细胞上过表达猪TRIM32分子，可显著地抑制PRRSV 的复制；相反，在Marc145细胞上干扰TRIM32的表达，可明显增加PRRSV 的复制。
因此，我们的研究结果初步揭示了猪TRIM32分子具有抗PRRSV 感染的作用，为进一步探究猪TRIM32抗HP-PRRSV 感染的机制奠定基础。
关键词：TRIM32；真核表达；抗病毒反应；HP-PRRSV 中图分类号：S852.4文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）03-0158-06Cloning, Expression and Functional Analysis of Porcine TRIM32LI Hui, ZHANG Yanbing, XIE Yixuan, LU Yan, XIANG Xiao, LIU Ke, WEI Jianchao, LI Zongjie,SHAO Donghua, LI Beibei, MA Zhiyong, QIU Yafeng(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2020-02-19基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费（2020JB04）；国家自然科学基金（31972693）；中国农业科学院青年英才项目（CAASQNYC-KYYJ-26）作者简介：李慧，女，硕士研究生，兽医学专业通信作者：邱亚峰，E-mail：****************.cn Abstract: TRIM32 is a member of TRIM family and plays an important role in host immune defense. However, it is little known about the role of porcine TRIM32 in innate antiviral response. In the present study, we fi rst cloned the porcine TRIM32 gene from pig lung by using RT-PCR, and the recombinant plasmid pFlag-porTRIM32 was constructed by inserting the porcine TRIM32 gene into p3xFlag-CMV-14 vector. Subsequently, effect of porcine TRIM32 on PRRSV infection was determined in Marc145 cell line by the gain-of-function analysis through over expression of pFlag-porTRIM32. Moreover, we further set up the loss-of function analysis through knockdown expression of endogenous TRIM32 in Marc145 cell line using RNA interference. Our results demonstrated that the recombinant plasmid pFlag-porTRIM32 was successfully constructed and anti-Flag antibody recognized recombinant protein Flag-porTRIM32 transiently expressed in 293T cell line in Western blotting. Overexpression of porcine TRIM32 in Marc145 cells inhibited PRRSV infection in comparison to infected-vector-group. In contrast, knock-down expression of endogenous TRIM32 in Marc145 cell line increased virus titters compared with those in infected-NC group. Thus, the results of this study not only revealed that porcine TRIM32 had a role in anti-PRRSV infection but also provided a basis for understanding insights into effect of TRIM32 on anti-PRRSV infection.Key words: TRIM32; eukaryotic expression; antiviral response; HP-PRRSV2023,31(3):158-163李 慧，张彦兵，解艺璇，陆 艳，相 笑，刘 珂，魏建超，李宗杰，邵东华，李蓓蓓，马志永，邱亚峰（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）· 159 ·李 慧等：猪TRIM32分子的克隆、表达及其功能分析第31卷第3期TRIM32（The tripartite motif 32）作为TRIM家族中的成员之一，与TRIM家族其他成员的结构相似，其N端具有典型的RBBC结构，即一个RING结构域、两个B-BOX结构域、一个Cioned-coin卷曲螺旋结构域，与此相连的为1个间隔片段和6个NHL 重复序列[1-2]。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
转基因技术的原理应用
转基因技术的原理应用一、转基因技术的概念转基因技术（transgenic technology）是将外源基因导入一个生物体，使其在表现型和遗传性状上发生改变的一种技术。
在转基因过程中，通过人工手段将一个或多个外源基因导入目标生物体的染色体，从而改变目标生物体的基因组成。
二、转基因技术的原理转基因技术主要包括以下几个步骤：1.基因选择：选择合适的外源基因，这些基因往往来源于其他物种，可以是具有特定功能的基因，如抗病基因、耐草药基因等。
2.基因克隆：将选择的外源基因进行扩增和纯化，利用分子生物学技术制备大量目标基因的复制体。
3.载体构建：将目标基因插入到某种载体中，常用的载体有质粒、病毒等，通过转化等方式将目标基因导入载体中。
4.转染：将得到的载体导入目标生物体的细胞中，使目标基因被细胞摄取和表达。
5.筛选与鉴定：通过标记、筛选等手段，识别并筛选出带有目标基因的细胞，进一步验证目标基因是否成功表达。
6.培育与繁殖：将成功表达目标基因的细胞进行培养和繁殖，从而获得具有目标基因的转基因生物体。
三、转基因技术的应用转基因技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用，以下是一些常见的应用案例：1. 农业领域•抗病虫害作物：通过导入抗病虫害基因，使作物获得抗性，减少农药的使用，提高作物的产量和品质。
•耐逆环境作物：通过导入耐旱、耐盐碱等相关基因，使作物在恶劣环境下生长，提高作物的适应性和产量。
•改善营养成分：通过导入相关基因，提高作物的营养成分含量，如富含维生素、蛋白质等的作物。
2. 医学领域•基因治疗：通过导入缺失或异常基因，纠正患者的遗传病变，实现基因治疗，如用于治疗遗传性疾病、某些癌症等。
•生物药物生产：利用转基因技术大量制备生物药物，如重组蛋白、抗体等，提高产量和效果。
3. 工业领域•生物降解：利用转基因菌株生产具有降解能力的酶，用于污染物的降解，实现环境友好型生产。
•生物能源：利用转基因技术改良微生物，在生物质降解和发酵过程中提高产氢、产乙醇等有机能源的效率。
水稻转录因子与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定
水稻转录因子与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的经济作物之一，其是许多人口众多的亚洲国家的主要粮食作物。
长穗性状在水稻生长发育中起着重要作用，这是因为长穗可以使水稻生产更多的籽粒，进而提高水稻的产量。
因此，对于长穗性状的研究具有重要的理论意义和应用前景。
本文主要阐述了水稻中与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定。
一、水稻转录因子与长穗性状在水稻中，转录因子（Transcription factor，简称 TF）在调控基因表达方面起着重要作用。
这些因子可以诱导或抑制基因的转录，从而控制诸如生长发育、代谢、胁迫响应等生命过程。
在过去的十几年中，基于水稻基因组数据和遗传学实验研究，已克隆了一系列与水稻长穗有关的转录因子，如OsMADS22、OsMADS55、OsMADS50、OsMADS56、OsMADS61、OsMADS57等。
这些转录因子编码的蛋白在不同的生长阶段和组织中有不同的表达模式，并参与了水稻的长穗发育。
二、长穗性状相关基因的克隆和表达谱分析随着生物技术的不断发展，逐渐出现了一些新的高效实验手段，如全基因组测序、基因芯片技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术等，这些技术不仅可以检测全局基因组的表达谱，更可以破译单个基因与性状相联系的物质、细胞和生理过程。
通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学的手段，研究人员揭示了长穗性状调控中的关键基因以及相关的代谢途径和基因网络。
例如，Wang 等人 [1] 通过转录组学手段分析了长穗水稻品种和短穗水稻品种的基因表达谱，发现了一批与长穗发育相关的基因，这些基因中包括了一些编码转录因子、激素合成酶、代谢相关酶、信号传递器和RNA修饰因子等。
这些基因与长穗性状的形成和发育密切相关。
三、克隆和功能鉴定OsMADS22OsMADS22编码的TF在水稻的生长发育中起着重要作用，特别是在长穗的形成和发育过程中扮演着有重要的角色 [2]。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备※基本流程提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。
1）实验前准备预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。
2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。
（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。
（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
1.目标选择：确定需要修改的目标基因和目标生物体。
目标基因是指
具有特定功能或性状的基因，目标生物体是指需要进行基因改造的生物体。
2.基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来。
这通常是通过使用酶
切酶酶切DNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）等技术复制目标基因。
3.基因载体构建：将目标基因插入到合适的基因载体中。
基因载体是
一种可以携带外源基因并将其稳定地转移到目标生物体中的分子。
常见的
基因载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
4.转化：将构建好的基因载体转移给目标生物体。
转化可以通过物理
方法（如电穿孔、基因枪等）或化学方法（如钙磷共沉淀法、电渗法等）
进行。
5.筛选与鉴定：使用适当的筛选方法来确定是否成功转化目标生物体。
这通常涉及在转化后检测生物体中的目标基因或目标表型。
6.获得纯合系：当目标基因转移到目标生物体中后，需要经过繁殖和
筛选多代，以获得更稳定、纯合的基因型。
7.功能验证：对获得的转基因生物进行功能验证，确定目标基因是否
能够发挥预期的作用。
8.产业化应用：对功能验证通过的转基因生物进行进一步研究和开发，以满足具体的临床、农业或工业应用需求。
需要注意的是，基因工程操作需要严格依照伦理规范和法律法规进行，并进行充分的风险评估和安全措施，以确保操作的安全性和可行性。
基因的实验报告
一、实验目的1. 理解基因的概念、结构及功能；2. 掌握基因克隆、表达及功能分析的基本实验技术；3. 分析基因表达与调控的关系。
二、实验原理基因是生物体内具有遗传信息的DNA片段，是生物遗传的基本单位。
基因通过转录和翻译过程，指导生物体内蛋白质的合成，从而实现生命活动的调控。
本实验主要涉及以下内容：1. 基因克隆：通过PCR技术扩增目的基因，将其克隆到载体上，构建基因表达载体；2. 基因表达：将构建好的基因表达载体转化到宿主细胞中，观察目的基因的表达情况；3. 基因功能分析：通过观察目的基因表达产物在细胞内的功能，分析基因的功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）目的基因DNA模板；（2）PCR引物；（3）限制性核酸内切酶；（4）DNA连接酶；（5）克隆载体；（6）宿主细胞；（7）表达载体；（8）质粒提取试剂盒；（9）DNA电泳试剂；（10）Western blot试剂。
2. 实验仪器：（1）PCR仪；（2）电泳仪；（3）凝胶成像系统；（4）Western blot系统；（5）离心机；（6）PCR仪；（7）酶标仪。
四、实验步骤1. PCR扩增目的基因：设计特异性引物，以目的基因DNA为模板，进行PCR扩增。
2. 克隆载体构建：将PCR扩增的目的基因与克隆载体连接，构建基因表达载体。
3. 转化宿主细胞：将构建好的基因表达载体转化到宿主细胞中。
4. 质粒提取：从转化后的宿主细胞中提取质粒。
5. 阳性克隆鉴定：通过PCR和酶切鉴定阳性克隆。
6. 基因表达分析：通过RT-qPCR检测目的基因在细胞中的表达水平。
7. Western blot检测：通过Western blot检测目的蛋白的表达情况。
8. 基因功能分析：通过观察目的蛋白在细胞内的功能，分析基因的功能。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增获得目的基因，大小与预期一致。
2. 克隆载体构建：通过酶切和PCR鉴定，成功构建基因表达载体。
基因工程的主要步骤
基因工程的主要步骤基因工程的主要步骤包括：1. 目标基因的选择：首先确定要操作的目标基因，可以根据研究的目的或应用的需求来选择。
2. 基因克隆：将目标基因从其来源细胞或组织中分离出来，并通过聚合酶链式反应（PCR）等方法扩增出一定数量的目标基因。
3. 载体构建：选择一个适当的载体，如质粒（plasmid）或病毒，将目标基因插入载体中。
4. 转化：将构建好的质粒或病毒载体导入到宿主细胞中，可以采用化学方法或生物方法（如电穿孔或基因枪等）来实现。
5. 选择与鉴定：利用选择标记或荧光标记等方法，筛选出成功获得目标基因的宿主细胞，并通过PCR、Southern blot等技术验证插入的基因是否正确。
6. 表达与分析：利用适当的启动子和调控元件使目标基因在宿主细胞中得到表达，并进行产物的分离纯化和活性分析。
7. 应用与验证：将获得的基因工程产物应用于相关领域的研究或应用中，并通过实验验证其功能和效果。
需要指出的是，这只是基因工程的一般步骤，并不适用于所有具体的基因工程项目，不同的项目可能会有不同的步骤和操作方法。
8. 后续处理：对于表达的目标基因产物，可能需要进行后续处理，如纯化、结晶或修饰等，以提高其纯度和稳定性。
9. 功能验证：对基因工程产物进行功能验证，通过实验或测试来验证其目的是否得到实现，如酶活性测定、蛋白质互作分析等。
10. 优化和改进：根据功能验证的结果，对基因工程的产物进行优化和改进，以提高其效率、产量、特异性等性能。
11. 安全评估：对基因工程产物的安全性进行评估，包括生物安全性和环境风险评估，确保其在应用中不引起不良后果。
12. 生产与应用：基因工程产物经过上述步骤后，可以进行批量生产，并应用于相关领域，如医药、农业、工业等。
这些步骤是基因工程项目的一般流程，具体步骤和方法可能会因为不同的目标基因和应用领域而有所差异。
在每个步骤中，科学家需要仔细设计实验，选择合适的实验方法和技术，并进行数据分析和结果解读。
构建过表达载体植株特性功能验证流程简介
构建过表达载体植株特性功能验证流程简介下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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过表达pi3k的实验步骤
过表达pi3k的实验步骤过表达PI3K的实验步骤涉及多个阶段，包括基因构建、转染、表达验证等。
具体如下：1. 基因构建：-设计引物：根据目的基因mRNA编码区设计引物，并在引物两端加入酶切位点，如EcoRI 和Bgl II。
-提取mRNA：从细胞中提取目的基因的mRNA。
-逆转录：将mRNA逆转录成cDNA。
- PCR扩增：使用设计好的引物，通过PCR技术从cDNA中扩增出带有酶切位点的目的基因编码区序列。
2. 载体构建：-酶切：将目的基因和载体质粒进行酶切处理，以获得相应的粘性末端。
-连接：将酶切后的目的基因与载体质粒连接，形成重组质粒。
-转化：将重组质粒转化到宿主细胞中，如大肠杆菌。
-筛选：通过抗生素筛选出含有重组质粒的细菌克隆，并进行序列验证。
3. 细胞转染：-选择合适的细胞系进行转染，如使用脂质体介导的转染方法或其他商业化转染试剂。
-将重组质粒转染到目标细胞中，使细胞表达外源的PI3K基因。
4. 表达验证：-通过Western blotting、RT-qPCR等方法检测PI3K蛋白或mRNA的表达水平，以验证过表达效果。
-可以通过观察PI3K下游信号通路的变化来进一步确认PI3K的活性，例如检测Akt的磷酸化状态。
5. 功能研究：-根据实验目的，进行相关的功能实验，如细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为的检测。
-可以使用特异性的小分子抑制剂来研究PI3K信号通路的功能，例如研究p110α亚型在PI3K信号通路中的作用。
需要注意的是，在进行过表达实验时，应该设置合适的对照组，以确保实验结果的准确性。
此外，实验过程中可能会遇到的问题需要及时解决，以保证实验的顺利进行。
基因工程技术的核心步骤
基因工程技术的核心步骤一、引言基因工程技术是一种能够改变生物体基因组的技术，它已经在医学、农业、生物技术等领域得到了广泛应用。
基因治疗是基因工程技术应用的重要方向之一，它有望从根本上治愈一些现有的常规疗法不能解决的疾病。
本文将详细介绍基因工程技术的核心步骤，包括基因克隆、基因表达、基因转化和基因检测等。
二、基因克隆基因克隆是基因工程技术的第一步，它的目的是将目标基因从生物体中分离出来，并进行复制和扩增。
基因克隆的基本步骤包括：1. 准备基因组DNA：从生物体中提取基因组DNA，这是后续基因克隆的基础。
2. 限制性酶切：使用限制性酶将基因组DNA切割成片段，以便后续的克隆操作。
3. 连接DNA片段：将切割后的DNA片段连接到载体DNA上，形成重组DNA分子。
4. 将重组DNA分子导入宿主细胞：将重组DNA分子导入细菌等宿主细胞中，以便进行复制和扩增。
5. 克隆筛选与鉴定：对克隆进行筛选与鉴定，确定目标基因是否已经成功克隆。
三、基因表达基因表达是基因工程技术的重要环节之一，它能够使目标基因在特定细胞或组织中表达，从而产生具有特定功能的蛋白质或RNA。
基因表达的基本步骤包括：1. 构建表达载体：将目标基因连接到表达载体上，以便在特定细胞或组织中表达。
2. 转染细胞：将表达载体转入目标细胞中，以便目标基因能够在其中表达。
3. 检测基因表达：通过各种检测方法，如Western blot、RT-PCR等，检测目标基因是否已经成功表达以及表达水平如何。
4. 功能验证：对表达产物进行功能验证，以确定其是否具有预期的功能。
四、基因转化基因转化是指将外源基因导入另一种生物体内，以改变其遗传特性或产生新的性状。
基因转化的基本步骤包括：1. 准备受体细胞：从另一种生物体中提取受体细胞，以便接受外源基因的转化。
2. 转化操作：将外源基因导入受体细胞中，常用的方法包括电穿孔法、磷酸钙沉淀法等。
3. 筛选与鉴定：对转化后的细胞进行筛选与鉴定，确定是否成功转化了外源基因，并鉴定转化的效率和稳定性。
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基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、基因克隆★事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备※基本流程提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。
1）实验前准备预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。
2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。
（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。
（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。
（6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
（7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。
（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。
（9）配制以下体系：10×DNase buffer 5 μlDNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μlRNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μlTotal RNA 70 μg加去RNase水至总体积为50 μl（10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。
（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。
（12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。
3）RNA的质量及纯度检测（1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。
（2）分光光度计RNA纯度检测取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。
4）cDNA第一条链的合成按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：1）在Eppendorf管中配制下列混合液：试剂名称使用量模板RNA 1 µgOligo dT primer (50 µM) 1 µldNTP Mixture(10 mM) 1 µlRNase free dH2O up to 10 µl2）65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。
3）离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。
4）在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:试剂名称使用量上述模板RNA/引物等的混合液10 µl5×Frist-Stand Buffer 4 µlRNase Inhibitor(40 U/ µl) 0.5 µlMTV RT ase (10 U/μl) 0.5 µlRNase free dH2O up to 20 µl5）37 ℃保温60 min。
6）95 ℃,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取（1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml4MNaCl 1.5 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 ℃水浴预热。
（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。
（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 ℃离心10 min。
（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4℃离心10 min。
（6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 ℃保存过夜。
（7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。
（8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10×buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas 抑制剂），37 ℃30分钟（再加500 ul水）（9）取出用300 ul氯仿和300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm4 ℃离心10 min。
（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 ℃离心10 min。
（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇，-80 ℃冰箱过夜；（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。
2.2.2.1 cDNA第一条链的合成（1）基因组DNA的去除反应试剂使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ulgDNA Eraser 1.0 ulTotal RNA 5 ulRNase Free dH2O up to 10.0 ul42 ℃2 min4 ℃10 min(2)反转录反应试剂使用量5xPrimeScript@Buffer 2(for Real Time) 4.0 ulPrimeScript@RT Enzyme MixI 1.0 ulRT Prime Mix 1.0 ul①的反应液10.0 ulRNase Free dH2O up to 20.0 ul37 ℃15 min85 ℃ 5 sec4 ℃10 min -20 ℃保存备用2.基因cDNA克隆2.1基因片段的PCR扩增以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系为20ul：10×PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6 ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O补足至20 ul。
按照下列条件进行PCR扩增：94 ℃ 4 min94 ℃ 30 sec50 ℃ 40 sec 30 cycles72 ℃ 1 min72 ℃ 10 min2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有0.5 ug/ml溴化乙锭)上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV)，称重。
2) 按每100 mg 琼脂糖胶加入300 ul溶胶液PN，置于50 ℃水浴中10 min，每隔2 min 混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。
3) 将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，离心30 sec。
3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30 sec。
4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心30 sec。
5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入500 ul漂洗液PW，13000 rpm离心30 sec，重复一次。
6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2 min。
7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70℃洗脱液EB，室温放置5 min。
8) 12000 rpm，离心l min，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20℃保存备用。
2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。
具体操作步骤如下：SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。
在0.2ml离心管中配制反应体系10ul：PMD18-T 载体0.5 ulSolutionI 5 ul回收DNA产物 4.5 ul混匀，16 ℃反应过夜（3h就可以）。
连接反应快结束时，从-80 ℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融化。
1）取5 ul 的连接产物加到50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min。
2）将离心管置于42 ℃水浴90 s，间不要摇动离心管。
取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，其3）向离心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液体培养基，150r/min，37℃震荡培养60 min。
4）吸取150 ul 已摇好的菌液涂布在含有Amp(终浓度50 ug/ml)的LB固体培养基上，待液体完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃，培养12-14小时。