western-blot-全过程-详细步骤复习课程
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3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min
4.胶取出，在transfer buffer里泡10min
5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）
6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）
四：封闭、一抗、二抗
1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h37度
2.一抗4度12h
7.预电泳，100v，10-15min
8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul
9.60v 10-20min，之后100-110v
三：转膜
1.配transfer buffer，用10*transfer buffer稀释10倍，并加20%甲醇
2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸
western-blot-全过程-详细步骤
一：提蛋白：
1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。
2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。
3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。
9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。
二：跑胶
1.1.0玻板，洗干净
2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml
3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇
4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml
5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子
6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）
3.pbst洗膜，3次，每次10min
4.二抗（1:5000）1h37度
5. pbst洗膜，3次，每次10min
6.显影剂A和B各300ul
PBST：1000ml’PBS+1mltween
5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉
10*running buffeFra Baidu bibliotek：tris30.3g甘氨酸144.1gsds10g加水至1000ml
10*transfer buffer：tris30.3g甘氨酸144.1g加水至1000ml
1*transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml
4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。
5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。
6.每孔加200ulA/B混合液。
7.37度半小时。
8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）
4.胶取出，在transfer buffer里泡10min
5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）
6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）
四：封闭、一抗、二抗
1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h37度
2.一抗4度12h
7.预电泳，100v，10-15min
8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul
9.60v 10-20min，之后100-110v
三：转膜
1.配transfer buffer，用10*transfer buffer稀释10倍，并加20%甲醇
2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸
western-blot-全过程-详细步骤
一：提蛋白：
1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。
2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。
3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。
9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。
二：跑胶
1.1.0玻板，洗干净
2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml
3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇
4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml
5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子
6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）
3.pbst洗膜，3次，每次10min
4.二抗（1:5000）1h37度
5. pbst洗膜，3次，每次10min
6.显影剂A和B各300ul
PBST：1000ml’PBS+1mltween
5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉
10*running buffeFra Baidu bibliotek：tris30.3g甘氨酸144.1gsds10g加水至1000ml
10*transfer buffer：tris30.3g甘氨酸144.1g加水至1000ml
1*transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml
4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。
5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。
6.每孔加200ulA/B混合液。
7.37度半小时。
8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）