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原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现?在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠,并聚集成为包涵体。

经过诱导,目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。

虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在,而多达95%(甚至更多)的蛋白则在包涵体中。

实验过程中,可以采取降低诱导温度,例如25–30°C,或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间,还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。

2、跨膜蛋白为什么很难表达?跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果,究其原理,目前众说纷纭很多种理论。

以我们浅薄的理解层面来看,主要有以下几个原因:跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接,形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构,这种结构与信号肽结构相似,对于原核细胞来说,简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程,有些蛋白是多次跨膜,对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

另外,对于疏水性的片段,在原核细胞中极易形成包涵体,疏水性多肽会抑制翻译过程,甚至与原核膜结构融合形成毒性,出于生物自我保护的本能,所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。

3、如何选择蛋白表达宿主菌?4、我们有哪些原核蛋白纯化方式?如何选择不同的纯化方式?答:我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。

1、常规情况下,一般携带融合标签(His标签,GST标签,sumo标签,Fc标签),我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白,用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白,亲和纯化的方便快捷。

2、如果需要目的蛋白不含有任何标签,怎么选择纯化方式?。

(1)可表达融合蛋白,用蛋白工具酶切割融合蛋白,再进行纯化除去工具酶。

此方法能快速得到蛋白。

(2)可表达不含标签的蛋白,进行离子、分子筛、疏水等纯化,通过AKATA纯化设备获得蛋白。

默克Novagen重组蛋白表达技术

默克Novagen重组蛋白表达技术

德国默克分子生物学技术介绍原核系统重组蛋白表达技术何煜 Allen He2009.0921-Sep-09Page 1• 重组蛋白: 重组蛋白:• • • 抽提、纯化、去标签、鉴定 蛋白重折叠(复性) 高通量表达-纯化-分析 膜蛋白抽提,亚细胞分部收集 去除高丰度蛋白等 抑制剂混和物、蛋白定量、电洗脱、 透析/浓缩 、自动诱导发酵培养基等• 天然蛋白• •• 蛋白研究配套产品蛋白抽提、 蛋白抽提、纯化与分析——蛋白研究工具产品手册 蛋白研究工具产品手册第二版• •Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page2Strategies For Enhanced Solubility & Yield of Proteins Expressed in E.coli• Part 1: • Choosing a vector and cloning strategy • Part 2: • Selection of host and optimization of expression • Part 3: • Maximizing target protein recoveryNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page3Bacterial Protein ExpressionVectorHostGrowth conditionsNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page4Choices for Expression Plasmids• Level of control and expression • Antibiotic selection • Tag • Solubility • Protease recognition site • Copy numberNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page5Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page6关于载体的进展• 新的克隆方法: 新的克隆方法:更适合高通量操作• 新的启动子: 新的启动子:更高产, 更高产,多系统穿梭表达• 新的复制子: 新的复制子:多载体/多蛋白共表达 多载体 多蛋白共表达• 新的融合标签更好的纯化、可溶性、 更好的纯化、可溶性、检测• 新的蛋白酶切: 新的蛋白酶切:特异性更好, 特异性更好,更温和Novagen®21-Sep-09– pET · 蛋白研究专家Page7LIC cloning method1.Amplify target protein using any thermostable DNA polymerase and special primers2.Treat 50 min; PCR product, T4 DNA polymerase, and dATP3. 4. 5. Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09Anneal 5 min, then add EDTA Transform using NovaBlue GigaSingles™ Competent Cells PlatePage8Gateway® Nova DEST™ Vectors • • • • • •Universal cloning method based on bacteriophage lambda site-specific recombination. Rapid, efficient way to move DNA sequences into multiple systems for protein expression. Intermolecular DNA recombination is mediated by a mixture of lambda and E.coli-encoded recombination proteins (i.e. ClonaseTM II Enzyme Mix). Recombination occurs between specific attachment (att) sites on interacting DNA molecules. Recombination is conservative and requires no DNA synthesis. After recombination, att sites are hybrids of sequences donated by each parental vector.Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09Page9Gateway® Nova DEST™ Vectors•Two recombination reactions constitute basic Gateway® TechnologyattBGENEattBattPattPattLGENEattLattRattRccdB + CamccdB + Camusually attB-flanked PCR Product+pDONR Donor vectorBP ClonaseTM IIpENTR Entry clone+By-productattLGENEattLattRattRattBGENE LR ClonaseTM IIattBattPattPccdB + CamccdB + CampENTR Entry clone+pDEST Destination VectorpEXPR Expression clone+By-productNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page10Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page11Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page12Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page13Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page14Solubility tags• Secretion signal– pelB leader (22 amino acids) – ompT leader (20 amino acids)• Fusion to enzyme which promotes disulfide bonds– oxido reductase (208 amino acids, DsbA gene product) – disulfide isomerase (236 amino acid, DsbC gene product) – thioredoxin (109 amino acids)• Fusion to highly soluble protein– glutathione S-transferase (220 amino acids) – NusA gene product (495®amino acids)21-Sep-09Novagen – pET · 蛋白研究专家Page15Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page16University of Oklahoma School of Chemical Engineering and Materials Science Recombinant Protein Solubility PredictionSubmit Query ResetType (or cut and paste) your protein sequence below, click on the "Submit" button, and the solubility probability of your protein will be calculated. The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. If there are numbers, spaces, or other characters in your sequence, don't worry, they won't affect the calculation. For more information on the solubility model used here, see the references below. References: •R.G. Harrison. 2000. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations. 11:4-7. PDF file •Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and R.G. Harrison. 1999. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 65(4):382-8. PubMed Abstract •Wilkinson, D.L. and R.G. Harrison. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins Novagen® – pET · PubMed Abstract in Escherichia coli. Bio/Technology. 9: 443-448.蛋白研究专家21-Sep-09 Page17Improving solubility of IL-3Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page18Single plasmid for co-expressionNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page19Expression systems repliconsNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page20。

原核表达技术及其在相关领域的应用

原核表达技术及其在相关领域的应用

基因工程一般流程 人的细胞 提取 目的基因 与运载体DNA拼接 导入 细菌(含目的基因) 生产重组蛋白
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基因工程的操作工具
一. 核酸分子剪刀----限制性核酸内切酶 识别回文序列,产生粘性或平性末端,具有相同粘性或平性 末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子,故 DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识 别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名:EcoRⅠ(E:属名;co:种名;R:株;Ⅰ:发现次序)
原核表达技术及其在相关领域的应用
谨以此与朋友们交流学习
主要内容
1
基因工程及其应用 原核表达载体的构建 蛋白质的诱导与表达 常见问题以及解决办法
2
3
4
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基 因 工 程
基因工程:是用分离纯化或人 工合成的DNA在体外与载体DNA 结合,成为重组DNA,用以转 化宿主(细菌或其它细胞), 筛选出能表达重组DNA的活细 胞,加以纯化、传代、扩增, 成为克隆,产生出人类所需要 的基因产物或改造、创造新的 生物类型。
双酶切
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连接反应
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重组体的转化 1. 重组体导入大肠杆菌 (1)氯化钙法 (2)电击法 (3)体外包装法 2. 重组体导入哺乳动物细胞 (1)磷酸钙共沉淀法 (2)脂质体介导法 (3)病毒感染法 (4)显微注射法
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酶切反应
大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃条件下结冰。 当最终反应液中甘油浓度大于12%时,某些限制酶的识别特异性 降低,从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体 积的10%。 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大,小体积中过高浓度的 基因组DNA 会形成粘性 DNA溶液,从而抑制酶的扩散,并降低酶活 性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应 该尽量消化去除。 当要用两种或两种以上限制酶切割 DNA时,必须选择好通用缓冲液, 则两种酶才可同时切割。 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性。 酶切底物DNA应具备一定的纯度,如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙 醇,大于10mM的EDTA,SDS以及过量的盐离子浓度,都会不同程 度影响限制酶的活性。

原核表达个人秘籍

原核表达个人秘籍

秘笈:表达前的分析比什么都重要表达不同于其它一些实验,比如:提取质粒、PCR、电镜切片,这些人为控制的因素比较多,出问题相对来说也比较好分析。

表达呢,你把质粒克隆好啦,交给细胞,然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。

原核表达在表达当中来说还是比较简单,细菌培养条件简单、生长速度快,需要的仪器和培养基都比较便宜。

当然,它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。

原核表达从一开始的设计就非常重要,所谓好的开始是成功的一半。

做足准备功夫,可是省去很多将来后悔的事情。

首先,我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类,如果希望可以同时尝试多种表达系统,也有许多商业化的系统供选择。

前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系,现在我想先从自己的蛋白分析讲起。

同样的载体、同样的系统,很可能表达这个蛋白表达量奇高,但是另外一个就是做不出来,所以没有万能的载体,只有永恒的分析。

当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的,选择同样的载体表达成功率会高很多。

如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。

比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。

根据经验而言,含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。

在下面将列出几个影响表达的因素,大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下:1、翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点,所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了,一般情况下不需要自己再加,不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2、GC含量表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

GC含量可以利用DNA ST AR、Vector NTI Suite等软件进行预测。

3、二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。

原核表达步骤

原核表达步骤

实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列,用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计,并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。

引物如下:引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L,分装于Eppendorf管中,-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系:2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO(“万能溶剂”) 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF(底物) 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate(模板)5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件:①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(1)配置浓度为1%的凝胶。

称取琼脂糖0.3g,加入30ml 1×TAE电泳缓冲液(Tris-乙酸电泳缓冲液)中,用微波炉加热2min,待凝胶稍冷却,加入2μl EB(溴化乙锭,荧光染色剂)混匀后倾入凝胶铸槽中,插入梳子,并用玻璃棒驱除气泡,待凝胶完全凝结后拔除梳子。

(2)把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,加样孔置于负极一侧,然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品+10μl loading buffer(上样缓冲液,可以显示两条带,前面的蓝色的条带是溴酚蓝,代表的片段大小是300bp,后面的有点绿色的条带是二甲苯青,代表的片段大小在4000bp左右),盖上电泳盖,以100V电压进行电泳。

IPTG诱导蛋白表达的原理

IPTG诱导蛋白表达的原理

IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白,并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。

用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂,它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶,它是一种普遍应用的诱导剂,能诱导菌种表达多种外源基因。

但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多,我在网上查到以下一些内容,供查阅者借鉴。

最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子,乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合,使其构象改变离开lacO,从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。

tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子,且转录水平更高,比lacUV5更优越。

trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子,同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。

在常规的大肠杆菌中,lacI阻遏蛋白表达量不高,仅能满足细胞自身的lac操纵子,无法应付多拷贝的质粒的需求,导致非诱导条件下较高的本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达,能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。

现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因,以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。

IPTG 广泛用于诱导表达系统,但是IPTG有一定毒性,有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适,因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。

另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体,30度下抑制转录,42度开发。

热诱导不用添加外来的诱导物,成本低,但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果,而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流,这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选,尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。

原核表达的详细步骤

原核表达的详细步骤

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。

2. 注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性。

做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。

(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman。

原核表达的详细步骤

原核表达的详细步骤

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子.在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。

2. 注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。

(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman.在线网站预测(http://www-bimas。

原核表达步骤总结

原核表达步骤总结

原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上,然后通过转化到JM109或BL21等菌株中,诱导表达蛋⽩,然后进⾏蛋⽩纯化。

本实验⽅案的前提是,⽬的基因已克隆到载体,并已转进⼊JM109菌株中。

1.鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达(1)制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基,加⼊0.7ul Amp(100mg/mL),37o C200r/min摇床培养,过夜活化。

2. 以1:50⽐例(200ul),将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中,加⼊10uLAmp(100mg/ml),37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h,期间取样监控菌液的OD值,控制菌液OD600在0.6-1.0之间,以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。

(⼀般3h时,菌液浓度及达到标准,但是不同的基因对菌的影响不同,所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照(CK),其余7ml菌液加⼊7ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l),使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速,37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体,倾倒上清,每个离⼼管收集3ml培养物。

5. 加⼊1ml dH2O,将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤,8000r/min 离⼼2min,倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离⼼管中的⽔倒⼲净。

(⼆)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量,⼀般200ul⽐较合适)。

⽤漩涡器剧烈震荡,确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。

样品凉后,12000r/min离⼼3min,取每管的上清点样。

做原核表达的教训和体会

做原核表达的教训和体会

最近在做原核表达,包涵体。

以前也做过,但经验不多。

从园子里也学到不少。

一点失败的教训以及纯化过程中的体会,贴出来与大家共享,同时希望得到同行们的指正。

1. 首先介绍一下背景。

载体是novagen公司的pET22b,Amp 抗性。

菌株是Invitrogen的BL21 star DE3,是一个蛋白降解酶突变菌株,也就是说是一种优化表达菌株。

2. 第一次失败。

第一次做诱导的时候,重复了很多次,但总是诱导不出来。

PCR、酶切都正确。

但没等测序结果出来就开始做了。

失败了,曾在园子求助。

后来证明是引物错误。

我们实验室合成引物都要先发给purchasing office,然后才由他们与公司交涉。

这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。

教训:在实验过程中,再仔细都是不为过的。

引物来了后管壁上贴有序列,但我忽略了。

3. 第二次失败。

后来重新构建、转化、诱导。

第一次诱导时根本就没带。

见附图(图片质量太差了,下面几个帖会逐渐好转)然后开始闷头找原因。

周一下午5点我就接了DE3菌,由于那天人非常不舒服,去看医生了,等了很久,到第二天中午11点才转接!而且是按1:50转接的!也就是菌在转接之前培养了18 h!Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的(具体可以翻看分子克隆)。

到菌体生长到足够浓度的时候,培养基的Amp就会慢慢减少。

一旦细菌失去选择压力,就可能造成质粒丢失。

当Amp降到很低,不足以抑制细菌生长时,未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。

所以当培养时间足够长后,培养基中的B-内酰胺酶就会积累到很高的浓度。

转接时(我是1:50转的),高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp(而且我用的浓度是50 ug/ml)。

这样,就造成最后收集的菌中,大部分都是没有带质粒的菌了。

当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶,使得表达检测失败。

这两种推测都只是推测,但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。

在使用Amp抗性的时候要格外注意。

默克密理博pET原核表达工具简介

默克密理博pET原核表达工具简介

多亚基蛋白表达、目的蛋白-辅因子共表达 变得灵活、简便可控
11
16/05/2014
pET系列载体:满足各种表达要求
Strep•Tag ® II:pET-51,-52;提高纯度,>95% HRV 3C: pET-47,-48,-49,-50;低温切割保护蛋白 NusA: pET-43.1, -44, -50b;提高可溶性 GST: pET-41,-42;提高可溶性,纯化,活性检测 Trx: pET-32;提高可溶性 site-specific 32P-labeling: pET-33;目的蛋白标记 Peptide Expression: pET-31,小肽表达
5
16/05/2014
重要原则:选择合适的载体
• 提高产量和稳定性 • 蛋白定位与分泌 • 可溶性
• 特异性亲和纯化
• 检测**
pET系列
融合标签:
• 不同大小的C-或N-端 标签的不同功能与对 后续操作的影响 • 是否需要或容忍标签 的存在
6
16/05/2014
重要原则:选择合适的载体
pET系列
强势而可控
pET系列
T7Lac启动子 加强严紧控制 以获得更稳定 的表达
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16/05/2014
重要原则:选择合适的载体
pET系列
终止子:转录水平的
终止,也可考虑翻译 水平的终止
重要原则:选择合适的载体
pET系列
多克隆位点:
• pET系列共同的设计 便于亚克隆
• 决定了载体来源序列 在蛋白产物上的位置 和应用
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Type (or cut and paste) your protein sequence below, click on the "Submit" button, and the solubility probability of your protein will be calculated. The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. If there are numbers, spaces, or other characters in your sequence, don't worry, they won't affect the calculation. For more information on the solubility model used here, see the references below. References: •R.G. Harrison. 2000. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations. 11:4-7. PDF file •Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and R.G. Harrison. 1999. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 65(4):382-8. PubMed Abstract •Wilkinson, D.L. and R.G. Harrison. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology. 9: 443-448. PubMed Abstract

生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解

生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解

生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解在生物制药技术中,生长因子是一类可以促进细胞增殖、分化和发育的蛋白质信号分子。

它们在医药领域具有广泛的应用,常被用于治疗癌症、遗传性疾病和退行性疾病等。

为了获得高纯度的生长因子,生物制药技术中采用了一系列的表达和纯化方法。

本文将详细介绍生物制药技术中生长因子的表达与纯化方法。

生长因子的表达是指将相关基因导入到宿主细胞中,通过转录和翻译过程使基因表达为具有生物活性的蛋白质。

表达方法主要有原核表达和真核表达两种。

原核表达是将生长因子基因克隆到大肠杆菌等细菌的表达载体中,通过转化、培养和诱导等步骤使基因表达为目标蛋白。

在原核表达中,由于基因表达系统简单、成本较低且表达量较高,常被用于小规模的试验和研究。

然而,细菌中的表达系统无法正确翻译和修饰复杂的生长因子,因此并不适用于大规模生产。

真核表达是将生长因子基因克隆到真核细胞(如哺乳动物细胞)的表达载体中,通过转染、培养和诱导等步骤实现基因表达。

相比于原核表达,真核表达能够保留生长因子的天然结构和生物活性,因此更适用于大规模生产。

近年来,重组DNA技术的发展使得真核表达系统的建立更加高效,同时也提高了纯化效率。

表达获得的生长因子需要经过纯化才能得到高纯度的蛋白质。

生长因子的纯化方法一般包括以下几个步骤:细胞破碎、先导蛋白的去除、拟静态层析、亲和层析和尺寸排除层析。

细胞破碎是将表达获得的细胞打破,释放出蛋白质。

常用的方法有机械破碎、超声波破碎和高压破碎等。

破碎后的细胞溶液包含了大量的其他蛋白质和杂质,需要进行进一步的纯化。

先导蛋白的去除是为了排除掉无法识别的非生长因子蛋白质。

一般采用的方法是利用具有亲和性的纯化材料(如亲和树脂或金属螯合材料)结合标签或结构域与生长因子结合,以实现生长因子的分离和纯化。

拟静态层析是利用柱层析将目标蛋白与其他蛋白质分离。

常用的方法有离子交换层析、亲和层析和蛋白A/G层析等。

通过对样品的特定性质进行调整,可以实现目标蛋白质的选择性结合和洗脱。

从原核表达到抗体制备

从原核表达到抗体制备

一、实验前的分析目的:得到5mg纯目的蛋白,并制备一抗。

1、载体选择pET系列:目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达,目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌。

优点:·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC 载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆PCR产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。

该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA 聚合酶的转录(如果宿主菌DE3有pLysS或pLysE 的,亦可抑制T7RNA聚合酶的转录)。

除了根据载体/ 宿主菌组合控制T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性,pET 系统还根据诱导物( IPTG )浓度,对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。

pET 载体表达的蛋白用途:表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备;大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备;许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白,然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。

pET-30a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen(详细信息参考载体具体信息)2、引物设计载体一般都带有起始密码子和终止密码子,可以不另加,另外注意不要移码,还要看一下目的蛋白含不含信号肽,看情况选择是否去掉。

3、载体选择BL21是应用最广的宿主菌来源,具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。

原核蛋白表达与纯化

原核蛋白表达与纯化

GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
pEASY
His· Tag
选择表达菌株
菌株
BL21 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS
pGEX pET
Lane 2:30℃ Lane 3:25℃
促进包涵体形成
• 目的 高浓度,高纯度 毒基因表达
免受蛋白酶水解(小蛋白,多肽)
• 手段 胞质表达 提升表达速率(诱导温度,IPTG浓度,etc) 特定的表达载体(pET-17xb,pET-31b(+))
蛋白纯化障碍 • 表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程,蛋 白纯化过程中,很多问题的根源来自上游表达 • 蛋白不结合,洗脱杂带多,包涵体不易溶解…… • 下篇详述
常用表达载体系统
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达,纯化难以控制,谷 胱甘肽 一步洗脱,得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达,纯化难以控制,麦 芽糖一步洗脱,得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小,无需切割, 一般来说,对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag

原核表达操作步骤及注意事项

原核表达操作步骤及注意事项

原核表达操作步骤及注意事项时间:2010-03-03 14:05:01 来源:作者:点击:1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:(1)选择标志的编码序列;(2)可控转录的启动子;(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);(4)一个多限制酶切位点接头;(5)宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。

二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

蓝藻抗病毒蛋白N全长基因原核表达克隆的构建

蓝藻抗病毒蛋白N全长基因原核表达克隆的构建
M e h d e DNA o i g s q e c o t o s Th c d n e u n e f rCV— wa y te ie n mp i e y P N ss n s d a d a l d b CR, e a p i e C h z i f h m l d P R t i f
A s at Obet e T o s uth y n vr — ( V— fll g eepo ay t x rs o ln . b t c: jci ocnt c tecao inN C N) ule t gn rk ro cepes nc e r v r i — nh i i o
p o u t a ietd ye z m s d l e t E 3 a + v c rB 2 DE ) el w r a some i rd c w s g s n y e o d no T 0 ( ) e t . L 1( 3 c l ee r fr dw t d eb n a c n i p o s t n h p T 0 ( ) V N. h A wa e ui e d c n r d b A s q e c g e e e pe s n W E 3 a+ 一 - T e DN s t n p r d a o f me y DN e u n i ,g n x rsi a C h i f n i n o s id c dw t T Reu t T e E 3 a ) V N v co o l e p es 1 D fs npoe f i t n u e i I G s l h T 0 ( 一 - e tr ud x rs a 1 K i r t nei e l i h P s p + C c u o i fc n yn
术论
著 术

两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较

两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较

基因组学与应用生物学,2020年,第39卷,第9期,第4136-4144页研究报告Research Report两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较邱淑彬1,2荆韧威3郭正隆3谢晓东1,2*1天津农学院农学与资源环境学院,天津,300384;2天津市作物抗逆的机理及遗传改良国际联合研究中心,天津,300384;3天津医科大学基础医学研究中心,天津-牛津基因治疗联合实验室,天津,300070*通信作者,*************.cn摘要为了比较两种不同的原核表达载体体外表达纯化CP05-GFP蛋白的能力,本研究通过构建pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)、pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)、pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)三个原核表达质粒,诱导表达并纯化带有不同标签的CP05-GFP蛋白。

通过考马斯亮蓝染色技术比较两种不同的原核表达载体表达以及体外纯化CP05-GFP蛋白的能力,发现3个原核表达载体均能诱导表达出CP05-GFP蛋白,且能纯化出CP05-GFP蛋白,但是不同标签纯化CP05-GFP蛋白的纯化效率是不同的:pET28b-CP05-GFP (双His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,但其表达量低易纯化;pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,其表达量高但不易纯化;pGEX-6p-1-CP05-GFP (GST-Tag)原核表达系统可表达出足量的CP05-GFP(GST-Tag)蛋白,并且易纯化。

本研究有助于选择合适的载体进行融合蛋白的表达和纯化。

关键词原核表达,载体构建,蛋白纯化Comparison of Two Different Prokaryotic Expression Vectors in Protein Expression and PurificationQiu Shubin1,2Jing Renwei3Guo Zhenglong3Xie Xiaodong1,2*1College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;2Tianjin Joint Research Center for Crop Stress Resistant and Genetic Improvement,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;3Tianjin-Oxford Joint Laboratory Gene Therapy,Research Cen-ter of Basic Medical Science,Tianjin Medical University,Tianjin,300070*Corresponding author,*************.cnDOI:10.13417/j.gab.039.004136Abstract To compare the ability of two different prokaryotic expression vectors in the expression and purification of CP05-GFP in vitro,the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(Single His-Tag) and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors were constructed.Afterwards,the CP05-GFP proteins with different tags were expressed and purified.The expression efficiency of these two vectors and the ability of different tags to purify the CP05-GFP proteins were compared by coomassie blue staining.The CP05-GFP proteins with different Tags could be obtained from the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(single His-Tag)and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors.While the abilities of different tags to purify to purify CP05-GFP in vitro were compared by Coomassie blue staining technique.The results showed that the CP05-GFP protein with double His-Tag was expressed in a low level,but easy to be purified.In contrast,the CP05-GFP protein with a single His-Tag could be expressed with high abundance but difficult to be purified. Significantly,the CP05-GFP with a GST-Tag could be expressed with high abundance and easy to be purified.基金项目:本研究由国家自然科学基金(31771858)资助引用格式:Qiu S.B.,Jing R.W.,Guo Z.L.,and Xie X.D.,2020,Comparison of two different prokaryotic expression vectors in protein expression and purification,Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue(Genomics and Applied Biology),39(9):4136-4144(邱淑彬,荆韧威,郭正隆,谢晓东,2020,两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较,基因组学与应用生物学,39(9):4136-4144)体外重组蛋白表达技术已经渗透到生物学的各个领域。

如何做原核表达——面面俱到Novagen产品

如何做原核表达——面面俱到Novagen产品

之所以首先‎介绍Nov‎a gen公‎司的产品是‎因为用过它‎的pET系‎列载体,感觉很好用‎。

Novag‎e n的母公‎司是德国默‎克(Merck‎)公司,它是国际著‎名的化学及‎制药公司总‎部位于德国‎的Darm‎s tadt‎,已有300‎多年的历史‎。

已在全世界‎55个主要‎国家设立了‎分公司,其中在28‎个国家建有‎62个生产‎基地。

Novag‎e n公司出‎品的pET‎系列载体是‎目前应用最‎为广泛的原‎核表达系统‎,已经成功地‎在大肠杆菌‎中表达了各‎种各样的异‎源蛋白。

pET系列‎载体是利用‎大肠杆菌T‎7噬菌体转‎录系统进行‎表达的载体‎,其表达原理‎见下图。

T7噬菌体‎具有一套专‎一性非常强‎的转录体系‎,利用这一体‎系中的元件‎为基础构建‎的表达系统‎称为T7表‎达系统。

T7噬菌体‎基因编码的‎T7 RNA聚合‎酶选择性的‎激活T7噬‎菌体启动子‎的转录。

它是一种高‎活性的RN‎A聚合酶,其合成mR‎N A的速度‎比大肠杆菌‎R NA聚合‎酶快5倍左‎右。

并可以转录‎某些不能被‎大肠杆菌R‎N A聚合酶‎有效转录的‎序列。

在细胞中存‎在T7 RNA聚合‎酶和T7噬‎菌体启动子‎的情形下,大肠杆菌宿‎主本身基因‎的转录竞争‎不过T7噬‎菌体转录体‎系,最终受T7‎噬菌体启动‎子控制的基‎因的转录能‎达到很高的‎水平。

T7噬菌体‎启动子的转‎录完全依赖‎于T7 RNA聚合‎酶,因此T7 RNA聚合‎酶的转录调‎控模式就决‎定了表达系‎统的调控方‎式。

噬菌体DE‎3是λ噬菌‎体的衍生株‎,一段含有l‎a cⅠ,lacUV‎5启动子和‎T7 RNA聚合‎酶基因的D‎N A片段倍‎插入其in‎t基因中,用噬菌体D‎E3的溶源‎菌,如BL21‎(DE3)、HMS17‎4(DE3)等作为表达‎载体的宿主‎菌,调控方式为‎化学信号诱‎导型,类似于La‎c表达系统‎。

从开始涉及‎表达的时候‎可以根据是‎否要用基因‎本身的起始‎密码子进行‎选择,Novag‎e n公司仅‎提供三个载‎体:pET-21(+),pET-24(+)和pET-23(+)。

GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

蛋白纯化系统操作流程一、蛋白的诱导:蛋白原核表达1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中(分区划线),37℃培养过夜;2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中,37℃振摇过夜;3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中,振摇2h(留样1ml);4、加入一定终浓度IPTG,37℃诱导表达4h(留样1ml),离心,弃上清收集细菌。

存入4℃。

二、蛋白表达状态分析(可溶性or包涵体表达)取少量(1ml)诱导菌体沉淀,加入不含变性剂(如盐酸胍,尿素等)PBS(150μl),超声裂解。

分离上清和沉淀,分别SDS-PAGE电泳。

三、蛋白的纯化纯化前准备1.推荐在中性至弱碱性条件下(pH 7-8)结合重组蛋白。

磷酸盐buffer是常用的缓冲液,Tric-Cl在一般情况下可用,但要注意它会降低结合强度。

2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂3.若重组蛋白以包涵体形式表达,在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素注:1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析,若样品中包含盐酸胍,在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2.除利用咪唑洗脱蛋白,其它方法,如低pH 值法等可被应用,详见说明书Bingding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大,重组蛋白纯度越高。

但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。

合适的咪唑浓度需要优化。

Buffer 的准备所用的水及化学物质须是高纯度的。

Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低推荐bufferBingding buffer:20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl20- 40 mM 咪唑pH 7.4 (咪唑浓度是蛋白依赖的,可变!)Elution buffer :20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl500 mM 咪唑pH 7.4 (咪唑浓度是蛋白依赖的,可变!)样品准备样品需被充分溶解。

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之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体,感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克(Merck)公司,它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt,已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司,其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统,已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体,其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶,其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下,大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系,最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶,因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株,一段含
有lacⅠ,lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中,用噬菌体DE3的溶源菌,如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌,调控方式为化学信号诱导型,类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择,Novagen公司仅提供三个载体:pET-21(+),pET-24(+)和pET-23(+)。

如果你打算利用载体的起始密码子,那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达,选择加有不同标记的载体。

一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。

为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略:
1.与一个高度可溶的多肽联合一起表达,比如:谷胱甘肽S转移酶(glutathione
S transferase, GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)和N利用质A(N utilization substance A, NusA)。

2.转入一个酶催化二硫键的形成,如:硫氧还蛋白,DsbA,DsbC。

3.插入一个定位到周质空间的信号序列。

不同载体提供不同的标记,有的可以同时带有多个标记。

如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽,你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断,或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。

以下是Novagen载体带有标记及抗性的列表:
生物通注:带(+)指此载体利用f1作为复制起点
T7 Tag11 = 11 aa fusion tag T7 Tag260 = 260 aa fusion tag
signal seq. = signal sequence for potential periplasmic localization
I = internal tag N = N-terminal tag C = optional C-terminal tag
protease cleavage sites: T = thrombin E = enterokinase X = Factor Xa
LIC = ligation-independent cloning
以上载体都是采用抗生素抗性筛选,如果你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue 系列载体。

在重组技术上,Novagen除了传统的酶切、连接方式外,还有不需要连
接的克隆方式:Ligation-Independent cloning,简称LIC。

采用LIC方法的pET载体是线性化的,在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。

在设计PCR 扩增引物时加入与LIC载体互补的序列,PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。

通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。

一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选,之后再把阳性克隆转化进入表达菌株,如BL21(DE3)中,通过IPTG诱导进行表达。

而pETcoco 载体它引入了低拷贝控制元件,F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝,这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。

当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达,质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。

pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型,在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。

在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中,在含有pLysS 的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制,质粒可以更稳定地存在。

Novagen提供多种表达使用的菌株,为了提高表达量做出了各种改造,它们大致分为以下几个种类:
1.蛋白酶缺陷型
所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的,这包括有B834, BL21, BLR, Origami™ B, Rosetta™和Tuner™。

因此在纯化时可以保持蛋白
的稳定不被降解。

BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。

另外它的衍生
株BLR(DE3)是recA-,RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。

它的缺失,可以保证质粒的稳定。

2.保证所有细胞以同样量进行表达
Tuner™株及它的衍生株(Origami™ B和Rosetta™)是BL21菌株的lacY1
缺失突变型,在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。

Lac
渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的,这样使蛋白表达浓度
可以随着IPTG浓度而改变。

通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。

一般说来,低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。

3.二硫键形成与溶解性增强
二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用,而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶(gor)和/或硫氧还蛋白还原酶(trxB)缺陷型的,包括AD494,BL21trxB,Origami,Origami B和Rosetta-gami™。

在这些菌株中表达蛋白,可以更大程度促进二硫键的形成,并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。

4.稀有密码子的补给
不同物种有不同的密码子偏爱性,如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子,特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候,就会造成蛋白表达量极低,或者翻译提前终止。

Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的,它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA,包括AUA,AGG,AGA,CUA,CCC和GGA。

它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。

Rosetta系列是来自BL21lacY1,所以它具有BL21lacY1的所有特性。

5.硒蛋氨酸标记
B834是来源于BL21的蛋氨酸(met)营养缺陷型菌株。

它在高度特异活性
35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。

我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB,LB因为其成本低廉所以应用最为广泛,而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Express™ Autoinduction System。

使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导,它可以直接进行过夜培养。

在这种培养基中含有痕量金属,可以满足合成蛋白时对金属的需求。

同时提供除了各种氨基酸,这其中蛋氨酸是另外加入的。

这样培养基可以满
足细菌生长的各种需求,使细菌密度更高;可以自动诱导无需自己加IPTG;使蛋白更加容易溶于培养基中;并且如果需要的话,可以对蛋氨酸进行硒标记。

同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。

这些载体含有两个不同多克隆位点,可以插入两个外源蛋白基因,利用单独的T7 启动子, 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。

载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。

Novagen的原核表达载体可以说是一面金字招牌,有许多不同系列的载体、菌株供选择;与原核表达的各种相关产品都一应俱全,比如:载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品等等。

原核表达的东西要说真是一天一夜都说不完,今天就先说到这里吧。

之后还将介绍Invitrogen、Qiagen等公司的各种载体及相关产品,请继续留意。

(生物通谢菲)
VVN打岔:本文部分内容来自Novagen的pET手册——一本非常值得推荐的手册,绝非简单的介绍产品,看完后你会对整个原核表达的诸多细节有深刻的理解,着实推荐每个已经在做表达或者即将开始做表达的同学认真学习,即使你不打算用pET 系列,你也会获益匪浅。

而且Merck生化小组已经将册子中文化印刷成册。

我将电子版中文手册放在新版生物通商城的表达系统的参考资料里,希望亲爱的何煜和陈文不会怒了吧,好东西值得分享哦。

VVN。

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