实验一 融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化●实验目的：1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。
●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。
IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。
融合蛋白纯化实验报告
1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。
二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。
融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。
该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。
三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。
四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。
2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。
3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。
4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。
5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。
6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。
1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。
2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。
3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。
4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。
六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。
2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。
3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。
4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。
七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。
质粒提取与分析 Protocol
质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。
下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。
质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。
o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。
o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。
o70%乙醇。
o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。
2.耗材：o移液器。
o离心管和离心管盖。
o 1.5ml微量移液器。
o无菌水。
o0.22μm滤膜。
o培养板和涂布器。
o细菌培养液（如LB液体培养基）。
o氯仿。
o异戊醇。
三、实验仪器1.实验室搅拌器。
2.高速冷冻离心机。
3.水浴锅。
4.无菌工作台或超净工作台。
5.紫外线分光光度计。
6.电泳仪和电泳槽。
7.显微镜。
8.恒温摇床或振荡器。
9.烘箱或微波炉。
10.量筒和烧杯。
11.计时器。
12.手套和实验服。
四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。
融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体的构建一、概述融合蛋白是把一个蛋白与其他物质混合在一起形成新的融合蛋白。
它们可以用于改善药物的药理学性质，广泛用于药物研究，疾病诊断，以及在医学和生物技术领域的应用。
为了有效地进行融合蛋白表达，科学家们需要设计一种质粒，它既能携带融合蛋白的基因信息，又能使表达的融合蛋白具有理想的性质，因此，构建融合蛋白表达载体就成为了研究者们的重要内容。
二、融合蛋白表达载体的构建1.质粒设计质粒设计是融合蛋白表达载体的核心部分，它能够携带融合蛋白的基因信息，并控制融合蛋白的表达。
一般而言，融合蛋白表达质粒包括表达调控基因、融合基因、保守克隆基因等几部分，其中表达调控基因以及保守克隆基因部分主要用于控制融合蛋白的表达，而融合基因部分则用于携带融合蛋白的基因信息，使其能够表达出想要获得的性质。
2.质粒的合成质粒设计完成之后，下一步就是将其合成成一种可用于融合蛋白表达的质粒。
一般而言，此步骤可以通过化学合成或者基因重组技术完成。
化学合成方法可以可靠地合成出想要获得的质粒，而基因重组技术则可以以更快的速度构建出相似的质粒。
3.表达测试表达测试是质粒构建过程中不可或缺的一部分，它能够检测融合蛋白是否能够正确表达，从而确定质粒是否构建成功并具有较好的表达能力。
表达测试通常包括定量PCR法、流式细胞仪法以及免疫印迹法等几种常见技术，这些技术都可以帮助科学家们及时发现融合蛋白表达存在的问题，从而指导科学家改进构建融合蛋白表达载体的工作。
三、结论融合蛋白表达载体的构建是科学家们针对融合蛋白表达问题所付出的努力，它包括质粒设计、质粒合成以及表达测试等几个步骤，有助于融合蛋白表达的安全、稳定和高效，并且可以提供药物及其他生物技术应用的理想基础。
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
四、获得含重组表达质粒的表达菌种1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
质粒提取实验报告分析
质粒提取实验报告分析引言质粒提取是分子生物学实验中常用的技术手段之一，可以用于获取目标质粒并纯化。
在本次质粒提取实验中，我们使用了传统的琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
本报告将对实验过程、结果和讨论进行详细的分析。
实验方法1. 质粒培养和提取1. 选取目标质粒进行大规模培养，添加适量的抗生素并摇床培养。
2. 收集培养液，离心沉淀并洗涤。
3. 使用琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
2. 质粒浓度检测1. 取提取得到的质粒样品，使用纳米比色计测量DNA的浓度。
2. 根据测量结果计算质粒的浓度。
实验结果1. 质粒提取情况根据琼脂糖凝胶柱层析法分离得到的质粒经紫外线照射后观察，发现提取效果良好，目标质粒很大程度上得到了纯化。
2. 质粒浓度检测根据纳米比色计的测量结果，计算得到质粒的浓度为XX ng/μl。
测量的标准曲线显示结果可靠。
结果分析1. 实验验证质粒提取的过程中，通过琼脂糖凝胶柱层析法有效地分离出了目标质粒，并得到了相对较纯的质粒样品。
通过紫外线照射观察质粒形态，进一步确认了提取效果良好。
2. 质粒浓度结果根据浓度检测结果，我们可以初步了解到质粒的含量。
这对后续实验的设计和操作非常重要。
结论通过本次实验使用琼脂糖凝胶柱层析法提取质粒，成功获得了相对纯净的目标质粒样品。
质粒的浓度检测结果进一步验证了实验的成功。
这为后续的实验研究和应用提供了基础数据。
改进和展望1. 实验中可以尝试使用其他提取方法，比较不同方法的效果并选取最佳方案。
2. 在质粒浓度检测方面，可以引入其他的分析方法，如凝胶电泳等，以更全面地评估质粒的品质。
参考文献[1] 张三, 李四. 质粒提取实验方法综述[J]. 生物技术通讯,20XX,XX(XX):XX-XX.。
质粒的提取与鉴定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。
实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。
GST-Glypican 3 N端融合蛋白表达载体构建及表达纯化
GST-Glypican 3 N端融合蛋白表达载体构建及表达纯化肖明兵;赵敏星;倪润洲;江枫;周嘉伟【摘要】目的构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)N端蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及纯化.方法以重组质粒pcDNA3.1-GPC3N为模板,扩增GPC3 N端基因,产物经纯化回收后与载体PGEX-4T-1连接并转化大肠埃希菌Rosetta,酶切鉴定序列完全正确者诱导表达GST-GPC3 N端融合蛋白,并以谷胱甘肽琼脂糖小珠亲和纯化.结果 Glypican 3 N 端基因片段成功插入载体PGEX-4T-1,插入位点及碱基序列完全正确,转化Rosetta 后,经IPGT诱导成功表达分子质量为64 000的GST-GPC3 N端融合蛋白.结论成功建立了重组GST-GPC3 N端融合蛋白的原核表达载体、表达菌株及诱导表达和纯化的方法,为GPC3 N端融合蛋白的进一步应用打下基础.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2010(028)003【总页数】3页(P212-214)【关键词】磷酯酰肌醇蛋白聚糖3;载体;克隆;表达【作者】肖明兵;赵敏星;倪润洲;江枫;周嘉伟【作者单位】南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;中国科学院上海神经科学研究所,上海200030【正文语种】中文【中图分类】Q78Glypican 3(磷酯酰肌醇蛋白聚糖3，GPC3) 可参与细胞增殖、分化、黏附等, 其异常表达与一些肿瘤关系密切[1-3]。
国内外已相继有表达GPC3 C末端融合蛋白的相关报道，但GPC3 N端融合蛋白的表达国内尚未见报道。
本实验室曾成功构建人GPC3 N端融合基因pcDNA3.1重组载体[4]。
载体构建实验报告模板
载体构建实验报告模板实验目的本实验旨在探究不同载体构建的效果，并评估其在基因转染中的表现。
实验原理1. 载体构建：选择合适的载体，将目标基因序列插入载体中，然后经过酶切和连接等步骤构建完整的载体。
2. 细胞培养：选择适合的细胞系，进行细胞培养，使其处于最佳的生长状态。
3. 基因转染：将构建好的载体转染至目标细胞，使目标细胞表达目标基因。
实验步骤1. 载体构建- 根据实验需要，选择适合的载体。
常用的载体有质粒、病毒等。
- 执行酶切。
将载体和目标基因进行相应的酶切，并进行凝胶电泳以确认切割效果。
- 进行连接。
将切割好的载体与目标基因连接，生成完整的载体。
- 进行质粒提取，获取纯化后的载体。
2. 细胞培养- 根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系有HEK293、CHO等。
- 预处理培养皿。
将培养皿用70%乙醇消毒后，进行干燥。
- 细胞解冻。
取出冻存的细胞，放置在37摄氏度恒温培养箱中，使其迅速解冻。
- 细胞培养。
将解冻后的细胞转移到预处理的培养皿中，加入合适的培养基，使其在恒温培养箱中继续培养。
3. 基因转染- 收集细胞。
在细胞密度达到一定程度后，停止细胞培养，收集细胞供后续转染使用。
- 转染操作。
根据实验要求，选择不同的转染方法，如细胞破裂法、化学转染法等。
- 转染后处理。
转染一定时间后，根据实验需要，对细胞进行相关的处理，如加入抗生素筛选等。
- 观察结果。
根据实验设计，选取适当的时间点，观察目标基因的表达情况。
实验结果与分析1. 载体构建结果- 根据酶切和凝胶电泳结果，确认目标基因成功插入载体中。
- 质粒提取结果良好，获得了纯化的载体。
2. 基因转染结果- 观察细胞形态，发现转染后的细胞形态与未转染的细胞有所不同。
- 进行目标基因表达定量分析，发现转染组的表达量明显高于对照组。
- 进行功能性实验，如细胞增殖、凋亡等，发现转染组在某些方面与对照组有明显的差异。
实验总结通过本实验，我们成功构建了目标基因载体，并将其转染至细胞中。
融合蛋白表达实验报告
基因构建与表达实验报告实验一目的基因扩增与纯化回收一、聚合酶链式反应实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。
实验原理：DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链；50-55℃引物与单链结合；70-72℃TaqDNA 聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’—3’方向合成新的DNA链。
经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。
实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头实验试剂：双蒸水（ddH2O）10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种10×dNTP 混合Taq酶（Easy Taq）DNA模板两种引物（上游和下游）实验步骤：试剂ddH2O Easy TaqBuffer dNTP EasyTaq酶甘油上游引物下游引物DNA模板100ul大体系6510100.210222注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配体系分装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下：(1) 94℃预变性4min；(2) 94℃变性1min；(3) 55℃退火1.5min；(4) 72 ℃延伸2min；(5) 重复(2)-(4)30个循环；（6）72 ℃终延伸10min；二、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。
实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。
在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。
溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其纯化的开题报告
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表
达及其纯化的开题报告
一、选题依据：
随着生物技术的发展，越来越多的融合蛋白被构建和应用于生物医学和工业生产领域。
Exendin-4Tβ4融合蛋白具有治疗糖尿病和愈合创伤的潜力，因此对其构建、表达和纯化进行研究具有重要意义。
二、研究内容：
本研究的主要内容包括：
1.设计Exendin-4Tβ4融合蛋白的基因序列，构建原核表达载体。
2.将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌中，进行表达。
3.对表达产物进行纯化的优化研究，找到最优的纯化条件。
4.对获得的纯化产物进行生化特性分析，包括分子量、活性和稳定性等方面的研究。
三、研究意义：
Exendin-4Tβ4融合蛋白是一种具有很高应用价值的重组蛋白，可在治疗糖尿病和促进创伤愈合等方面发挥作用。
本研究的结果将为其在生物医学和工业生产方面应用提供支持和参考。
四、研究方法：
1.基因合成和克隆：根据序列设计构建Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒。
2.转化及表达：将重组质粒转化到大肠杆菌，并通过诱导表达目标蛋白。
3.蛋白纯化：采用不同的纯化方法对重组蛋白进行分离纯化，并对
纯化后的样品进行鉴定和分析。
4.蛋白质特性分析：对获得的重组蛋白进行生物学特性、生化学特性、结构特性等方面的分析。
五、预期结果：
本研究预期利用原核表达系统构建出 Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒，并通过表达和纯化得到纯度高、活性强、稳定性好的重组蛋白。
同时，对其生化特性进行了深入研究，为其应用提供了实验数据和支持。
融合蛋白分析实验报告
一、实验目的本研究旨在分析融合蛋白的表达、纯化及其生物学活性，为后续研究融合蛋白的应用提供基础数据。
二、实验材料1. 融合蛋白表达载体：pET-28a（含目的基因融合蛋白）2. 菌株：BL21（DE3）大肠杆菌3. 试剂：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、DNase I、蛋白酶K、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western Blot试剂盒、小鼠抗目的蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗等4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Western Blot系统、紫外分光光度计等三、实验方法1. 融合蛋白表达将pET-28a表达载体转化至BL21（DE3）大肠杆菌中，挑选阳性克隆，在含IPTG 的LB培养基中培养至对数生长期，诱导表达融合蛋白。
2. 融合蛋白纯化收集诱导后的菌体，进行超声破碎，离心收集上清。
使用Ni柱亲和纯化上清中的融合蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。
3. 融合蛋白鉴定将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白条带。
使用Western Blot方法，将融合蛋白与小鼠抗目的蛋白单克隆抗体进行反应，检测目的蛋白的表达。
4. 融合蛋白生物学活性检测通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测融合蛋白的生物学活性。
四、实验结果1. 融合蛋白表达在IPTG诱导下，目的蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌中成功表达，分子量约为50kDa，与预期相符。
2. 融合蛋白纯化使用Ni柱亲和纯化目的蛋白，纯度达到90%以上。
3. 融合蛋白鉴定SDS-PAGE电泳结果显示，目的蛋白条带清晰，与预期分子量相符。
Western Blot检测结果进一步验证了目的蛋白的表达。
4. 融合蛋白生物学活性检测ELISA实验结果显示，融合蛋白具有生物学活性。
五、实验讨论1. 融合蛋白表达本研究成功在BL21（DE3）大肠杆菌中表达了目的蛋白，表达水平较高，为后续研究提供了丰富的蛋白材料。
酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建
酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建酵母菌表面展示是一种重要的生物工程技术，在生物学研究、抗原制备和疫苗研发等领域有广泛应用。
在进行酵母菌表面展示实验前，我们需要选择适合的载体并进行构建，以实现目标蛋白的表面展示。
本文将介绍酵母菌表面展示实验的载体选择与构建步骤。
一、载体选择在酵母菌表面展示实验中，常用的载体有质粒和整合载体两类。
质粒载体是通过直接瞬时表达目标蛋白来实现表面展示的，而整合载体则是通过将目标蛋白融合到约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白上，以实现表面展示。
根据实验要求和目标蛋白的特性，我们可以选择适合的载体进行后续实验。
二、质粒载体构建1. 提取质粒：选择适合的质粒载体并进行提取，一般可使用常见的质粒提取试剂盒进行操作，并按照试剂盒说明书进行操作。
2. 构建质粒：将提取的载体与目标蛋白基因进行连接。
可以选择PCR扩增、酶切和连接等方法进行操作。
在连接时注意选择合适的连接酶，避免不必要的损失和错误连接。
3. 转化酵母细胞：将构建好的质粒导入酵母细胞内。
可以采用电穿孔、化学转化等方法进行转化。
转化后，将转化后的细胞分别接种于含有适当选择压力的培养基上，筛选出含有目标质粒的酵母菌株。
三、整合载体构建1. 目标蛋白选择：根据实验需要选择合适的约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白，并设计引物进行PCR扩增。
2. 构建整合载体：将扩增得到的目标蛋白基因与整合载体中相应的表达位点进行连接，常用的有插入杂交、连接酶法等。
连接后的整合载体经测序确认无误后，可继续进行后续实验。
3. 酵母细胞转化：通过适当的方法，将构建好的整合载体导入酵母细胞内，使其整合到酵母细胞染色体上。
4. 酵母菌培养与筛选：将转化后的酵母菌培养在选择性培养基上，筛选出能够稳定表达目标蛋白的酵母菌株。
四、确认载体构建效果1. PCR鉴定：通过PCR方法对含有目标蛋白基因的质粒或整合载体进行鉴定。
根据目标蛋白的特异性引物，可以进行PCR扩增，并通过电泳分析判断目标蛋白基因的连接情况。
融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化
摘 要 ：以重组质粒 ｐＭＤ１８一Ｔ／ＩＬ６和 ｐＭＤ１８一Ｔ／ＯｍｐＷ 为模板 ，分别扩增 红笛鲷 ＩＬ一６基 因和哈维 氏弧 菌外膜蛋 白
ＯｍｐＷ 基因 ，运用 ＰＣＲ 重叠延 伸剪 切技 术 ，将 ＩＬ一６和 ＯｍｐＷ 基 因融合 ，将融合 基因定 ａ（＋），转化大肠杆 菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）感受 态 ，经异丙基— Ｄ一硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）诱导融合蛋 白高效表达 ，
（１．广 东 海洋 大学 水 产学 院 ，广 东 湛 江 ５２４０２５；２．广 东省 水产 经济 动物 病 原生 物学 及 流行病 学 重点 实验 室 ，广东 湛 江 ５２４０２５ ３．广 东省 水产 经济 动 物病 害控 制重 点 实验 室 ，广东 湛 江 ５２４０２５；４．仲恺农 业 工程 学 院 ，广 东 广州 ５１０２２５）
ＨＵＡＮＧＰｕ－ｊｊａｎｇｌ＇ 一，ＨＵＡ￣ＯＹｕ—ｃｏｎｇ ３，Ｊ！ＡＮ Ｊｉ—ｃｈａｎｇ 。
Ｗ Ｕ Ｚａｏ＿ｈｅ ’．ＬＵ Ｙｉ．ｓｈａｎ ．ＨＵＡＮＧ Ｙｕ ．ＦＡＮ Ｙｕｎ．ｘｉａ
（１．Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊａｎｇ ５２４０２５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇ ｙ ｆｏｒ Ａｑｕａｔｉｃ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０２５，
融合 蛋 白分子质 量约 为 ６６．６ ｋｕ。优 化后表达 条件为 温度 ３７℃，ＩＰＴＧ 浓度 ０．２ ｍｍｏｌ·Ｌ一，诱 导时 间 ５ ｈ。用
ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ亲和柱纯化重组蛋 白，最佳 咪唑洗脱 浓度为 ４００ ｍｍｏ］·Ｌ～，纯化蛋 白的质 量浓度为 ４８０ ｇｇ·ｍＬ～。
MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达
MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达尚丽平;李武峰【摘要】To construct the prokaryotic expression vector of pMal-C2G-mCTCF and induce the express~f fusion protein,DNA fragments encoding the mouse CTCF were generated by PCR using the plasmid pMXs-3Flag-mCTCF as a template,PCR products were digested with the restriction enzyme EcoR Ⅰ and SalⅠ and cloned into pMal-C2G expression vector.The plasmids were sequenced to confirm that there were no point mutations in the coding sequences.The constructed plasmids were transformed into E.coli BL21 to induce the expression of MBP-mCTCF fusion protein.The fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.The prokaryotic expression plasmids pMal-C2G-mCTCF were successfully constructed,which were testified by bacterial PCR,gene sequence and double restriction enzyme digestion analysis.We also got the suitable conditions for inducing fusion protein expression.The optimized induction condition was 37 ℃ with 10 × 10-4 mol/L IPTG for 6 hours to induce higher amount of MBP-mCTCF fusion protein.%为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-mCTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoR Ⅰ,SalⅠ双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定.将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果.经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10-4 mol/L IPTG浓度在37℃诱导6h.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2017(045)005【总页数】4页(P677-679,688)【关键词】CTCF;质粒构建;原核诱导表达【作者】尚丽平;李武峰【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q51CCCTC-结合因子（CTCF）是一种在生物体内广泛表达并在进化上高度保守的蛋白，鼠的CTCF全长736个氨基酸，包括N-末端（氨基端）、C-末端（羧基端）和锌指结构域（CTCF-ZFs）[1]。
实验一 融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析
编辑课件
实验一、融合蛋白表达载体构建的设计 与质粒提取分析
第一部分：分子实验相关知识
Part I： 实验课有关要求及注意事项 Part II： 分子生物学实验有关基础操作 Part III：基因克隆的原理 Part IV： 蛋白表达载体的构建
由于缺乏转录后加工机制只能表达克隆的由于缺乏转录后加工机制只能表达克隆的cdnacdna不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组dnadna由于缺乏适当的翻译后加工机制表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进由于缺乏适当的翻译后加工机制表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行行糖基化修饰糖基化修饰表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理理很难表达大量的可溶性蛋白
分类：根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性， 可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶， 切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。
同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切 割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
主要归结在表达载体的选择上。
编辑课件
一个合格表达载体的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生 物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
融合蛋白表达实验报告
基因构建与表达实验报告实验一目的基因扩增与纯化回收一、聚合酶链式反应实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。
实验原理：DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链；50-55℃引物与单链结合；70-72℃TaqDNA 聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’—3’方向合成新的DNA链。
经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。
实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头实验试剂：双蒸水（ddH2O）10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种10×dNTP 混合Taq酶（Easy Taq）DNA模板两种引物（上游和下游）实验步骤：试剂ddH2O Easy TaqBuffer dNTP EasyTaq酶甘油上游引物下游引物DNA模板100ul大体系6510100.210222注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配体系分装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下：(1) 94℃预变性4min；(2) 94℃变性1min；(3) 55℃退火1.5min；(4) 72 ℃延伸2min；(5) 重复(2)-(4)30个循环；（6）72 ℃终延伸10min；二、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。
实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。
在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。
溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。
融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化
融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化戚华兵;汪仕良;王凤君【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)22【摘要】目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。
方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。
结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG 诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。
结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。
【总页数】3页(P2213-2215)【关键词】原核表达系统;TAT蛋白转导结构域;缺氧诱导因子1α;PAS—B结构域【作者】戚华兵;汪仕良;王凤君【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q51【相关文献】1.抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 王晓晔;石博妹;王英群;李珣;刘徳玉;李铭;李芳芳;胡传活2.β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化 [J], 朱爱华;李敬;陆军;钱进;郑元林3.PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 杜琴;蔡嘉镜;蒋春萍;徐磊;张国元;王东生4.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春5.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切 割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
安装吸头
使用量程配套的吸头 将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上 轻轻用力向下压，同时把手中的移液器按顺时针
方向旋转180°，使吸头紧紧地扣在枪嘴上。
移液操作
一手拿住枪，另一手旋转转来设置你所要的容量。 把合适的枪头插入枪的末端，并轻微旋转一下。 把活动杆压下一档。这让枪定下你所要的容量。 把枪头直伸入液体约2-5mm深处。如果深入过深，
载体
供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制 的运载工具。功能：1.运送外源基因高效转入受体 细胞； 2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为 外源基因的扩增或表达提供条件。
载体具备条件
载体的分类
1.自主稳定复制 2.多克隆位点
按来源：质粒、噬菌 体、病毒
3.遗传标记 4.分子量小，插入容量大 5. 细胞内拷贝多 6.安全
昆虫谷胱氨肽-S转移酶基因
pPRO EX-HT载体
体外表达GST蛋白
GST nucleotide sequence and open reading frame (yellow)
GGCACGAGGCAACAAAATGGCCAAGAAACTACATTATTTCCATTTGAACGGGCTTGC TGAGTCCATCAGGTACATCCTGCACTACGGCGGACAAAAGTTCGAGGATGTCAGATA CGATCTGAAAAGCTGGCCCATCAAGAGTGTGAAAGACACTCTCCCATACGGCCAGCT GCCACTCTACGAGGAGGGAAATAAGACCCTAAACCAGTCACTGGCCATCGCGCGCTA CGTAGCTGCCCAGGTCCACCTCCTGCCCACCGATCCCTGGGAGCAGGCCGTCCTGGA TGCCATCGTCTTCAACATCTATGACTTCTGGGGAAAGATTCTGGTCTTCATCAAGGA GAATGATGCTGCTAAGAAGGAGGTAATCAAGAAGGAGATCATAAACGAATCCGTTGA CTTCTTCTTCTCCCGATTTGAGAAGGAACTTAAGGCCAACAAGGGATTCTTCAACGG AAAGCTGAGCTGGGCTGACTTCGTCCTTGTGGGCATCGTCGAGTCTGCAAACCTGTN CCTTGGCACCGAGATTGAGAAGAAATACCCCACCGTGCTCGTGCTCGTCCAGAAAAT CGCACCCTCCCTGGAGTGAAGGANTCATCGCGACTAGGAAACCATATGCTCTATAAA TAAAGTACACGTACTGTAAAAAAAAAAAAAA
进入吸头内；否则，可使吸入体积减少。
移液器的校正
在25℃时，水的密度大约为1g/ml （mg/ul）. 如要校正2-20ul 移液器，取10和20ul水于分析天平上分别
称三次。 如要校正20-200ul 移液器，测量100和200ul的水。 如要校正100-1000ul 移液器，测量500和1000ul的水。 如果你的移液器误差超过了5%，请通知老师。
BamHⅠ：
BglⅡ：
目的基因
cDNA：complementary DNA 经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。
基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
目前获取目的基因的几种途径或来源
1. 化学合成法R(从mRNA合成cDNA ) 4. 从染色体DNA中分离
主要归结在表达载体的选择上。
一个合格表达载体的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生 物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用
3. 黏性质粒（cosmid） 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。
表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核 糖体的基因序列组成了表达型载体。
不同类型载体容量
质粒pUC19的分子结构
①
③
②
④
重组DNA技术的基本流程
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达
操作方便、快捷，需时较短，表达量大， 适合工业化生产
大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：
①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA ② 由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进 行糖基化修饰 ③ 表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处 理 ④ 很难表达大量的可溶性蛋白。
实验流程
Part IV： 蛋白表达载体的构建
克隆基因的表达体系
1．原核表达体系
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核 表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制； 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
实验一 融合蛋白表达载体构建 的设计与质粒提取与分析
实验一、融合蛋白表达载体构建的设计 与质粒提取分析
第一部分：分子实验相关知识
Part I： 实验课有关要求及注意事项 Part II： 分子生物学实验有关基础操作 Part III：基因克隆的原理 Part IV： 蛋白表达载体的构建
第二部分：质粒DNA的提取及定量分析
将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差。 让活动杆慢慢地回到原始位置。否者，过快产生的
气雾将污染枪管和你的溶液。 让枪头在液中停一会，以便使液体完全进入枪头。
如果枪头从液中移开太快，可能会有空气在枪头中。 应目测是否有气泡或者所取的量是否符合你的要求。 把枪头贴在液面附近的管壁或管底，然后把液体 放出。须检查是否还有液体在枪头中，如是，慢慢 把液体放入管中。 把枪头去掉，扭回最大量程处。
移液操作tips
吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告 老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新 的头。
检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置 15 秒，观察 是否有液滴缓慢 的流出。若有流出，说明有漏气现象。
严禁吸液后将移液器平放！ 对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢
Part I： 质粒DNA提取的原理 Part II： 方法步骤 Part III： 结果与分析
分子生物学实验室一般安全知识
不能在实验室吸烟，或吃喝东西。 当使用危险或潜在危险物质时，请穿上工作服，戴上手套，
保护眼镜和口罩。 请记住，使用EB，酚等危险物质时，必须戴手套， 并且应
该经常水洗手套的外围，以免污染仪器等。当你离开实验 室时，务必脱掉手套方可离去。使用同位素及酚时，建议 戴两层手套。 废物的处理：废液，强酸及强碱（须稀释）等液体可以倒 入水槽，并放水冲走。废纸等固体废物应倒入垃圾桶。废 弃的微生物以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶 内以备消毒，培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作 普通物品处理。同位素实验的废液及物品，则分别倒在同 位素室里指定的容器里。EB胶倒在指定桶内。酚及氯仿及 盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内。破碎的玻璃 制品必须倒在特定的桶内。
离心管的使用
手持离心管时注意不要触碰离心管内表面， 包括盖子内表面
实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。
混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容 物收集至管底后再进行下步的实验。
实验过程中应做好每个样品的标记工作，且 一般在离心管上用记号笔作标记时，应在两 处重复做好标记。
基因克隆（DNA重组）
如化学物品溅到皮肤等，应马上用水冲洗。如轻微割伤并 没感染的话，可用红十字药盒里的止血贴，否则，马上送 医院。任何事故应马上报告老师。
量程：
0.5～10μl (读数窗显示0.5～10.0,精度为0.1μl) 5～50μl (读数窗显示5.0～50.0, 精度为0.5μl) 20～200μl (读数窗显示20～200, 精度为1μl) 100～1000μl (读数窗显示100～1000, 精度为5μl)
克隆基因的表达体系
2．真核表达体系
与原核表达体系比较，真核表达体系如酵 母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示 了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞， 不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真 核基因组DNA
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑， 比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达 产物的纯化方法等等。
工具酶
工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基 形成二酯键 a.合成cDNA的第二条链b.缺口平移c.测序d.补平 合成cDNA 催化多聚核苷酸5‘羟基末端磷酸化 同聚物加尾 切除末端磷酸基
表达导致质粒稳定性下降