实验一 融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化●实验目的：1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。
●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。
IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。
融合蛋白纯化实验报告
1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。
二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。
融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。
该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。
三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。
四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。
2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。
3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。
4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。
5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。
6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。
1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。
2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。
3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。
4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。
六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。
2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。
3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。
4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。
七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。
质粒提取与分析 Protocol
质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。
下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。
质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。
o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。
o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。
o70%乙醇。
o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。
2.耗材：o移液器。
o离心管和离心管盖。
o 1.5ml微量移液器。
o无菌水。
o0.22μm滤膜。
o培养板和涂布器。
o细菌培养液（如LB液体培养基）。
o氯仿。
o异戊醇。
三、实验仪器1.实验室搅拌器。
2.高速冷冻离心机。
3.水浴锅。
4.无菌工作台或超净工作台。
5.紫外线分光光度计。
6.电泳仪和电泳槽。
7.显微镜。
8.恒温摇床或振荡器。
9.烘箱或微波炉。
10.量筒和烧杯。
11.计时器。
12.手套和实验服。
四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。
融合蛋白表达载体的构建
融合蛋白表达载体的构建一、概述融合蛋白是把一个蛋白与其他物质混合在一起形成新的融合蛋白。
它们可以用于改善药物的药理学性质，广泛用于药物研究，疾病诊断，以及在医学和生物技术领域的应用。
为了有效地进行融合蛋白表达，科学家们需要设计一种质粒，它既能携带融合蛋白的基因信息，又能使表达的融合蛋白具有理想的性质，因此，构建融合蛋白表达载体就成为了研究者们的重要内容。
二、融合蛋白表达载体的构建1.质粒设计质粒设计是融合蛋白表达载体的核心部分，它能够携带融合蛋白的基因信息，并控制融合蛋白的表达。
一般而言，融合蛋白表达质粒包括表达调控基因、融合基因、保守克隆基因等几部分，其中表达调控基因以及保守克隆基因部分主要用于控制融合蛋白的表达，而融合基因部分则用于携带融合蛋白的基因信息，使其能够表达出想要获得的性质。
2.质粒的合成质粒设计完成之后，下一步就是将其合成成一种可用于融合蛋白表达的质粒。
一般而言，此步骤可以通过化学合成或者基因重组技术完成。
化学合成方法可以可靠地合成出想要获得的质粒，而基因重组技术则可以以更快的速度构建出相似的质粒。
3.表达测试表达测试是质粒构建过程中不可或缺的一部分，它能够检测融合蛋白是否能够正确表达，从而确定质粒是否构建成功并具有较好的表达能力。
表达测试通常包括定量PCR法、流式细胞仪法以及免疫印迹法等几种常见技术，这些技术都可以帮助科学家们及时发现融合蛋白表达存在的问题，从而指导科学家改进构建融合蛋白表达载体的工作。
三、结论融合蛋白表达载体的构建是科学家们针对融合蛋白表达问题所付出的努力，它包括质粒设计、质粒合成以及表达测试等几个步骤，有助于融合蛋白表达的安全、稳定和高效，并且可以提供药物及其他生物技术应用的理想基础。
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
四、获得含重组表达质粒的表达菌种1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
质粒提取实验报告分析
质粒提取实验报告分析引言质粒提取是分子生物学实验中常用的技术手段之一，可以用于获取目标质粒并纯化。
在本次质粒提取实验中，我们使用了传统的琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
本报告将对实验过程、结果和讨论进行详细的分析。
实验方法1. 质粒培养和提取1. 选取目标质粒进行大规模培养，添加适量的抗生素并摇床培养。
2. 收集培养液，离心沉淀并洗涤。
3. 使用琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
2. 质粒浓度检测1. 取提取得到的质粒样品，使用纳米比色计测量DNA的浓度。
2. 根据测量结果计算质粒的浓度。
实验结果1. 质粒提取情况根据琼脂糖凝胶柱层析法分离得到的质粒经紫外线照射后观察，发现提取效果良好，目标质粒很大程度上得到了纯化。
2. 质粒浓度检测根据纳米比色计的测量结果，计算得到质粒的浓度为XX ng/μl。
测量的标准曲线显示结果可靠。
结果分析1. 实验验证质粒提取的过程中，通过琼脂糖凝胶柱层析法有效地分离出了目标质粒，并得到了相对较纯的质粒样品。
通过紫外线照射观察质粒形态，进一步确认了提取效果良好。
2. 质粒浓度结果根据浓度检测结果，我们可以初步了解到质粒的含量。
这对后续实验的设计和操作非常重要。
结论通过本次实验使用琼脂糖凝胶柱层析法提取质粒，成功获得了相对纯净的目标质粒样品。
质粒的浓度检测结果进一步验证了实验的成功。
这为后续的实验研究和应用提供了基础数据。
改进和展望1. 实验中可以尝试使用其他提取方法，比较不同方法的效果并选取最佳方案。
2. 在质粒浓度检测方面，可以引入其他的分析方法，如凝胶电泳等，以更全面地评估质粒的品质。
参考文献[1] 张三, 李四. 质粒提取实验方法综述[J]. 生物技术通讯,20XX,XX(XX):XX-XX.。
质粒的提取与鉴定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。
实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。
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同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。
同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切 割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
安装吸头
使用量程配套的吸头 将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上 轻轻用力向下压，同时把手中的移液器按顺时针
方向旋转180°，使吸头紧紧地扣在枪嘴上。
移液操作
一手拿住枪，另一手旋转转来设置你所要的容量。 把合适的枪头插入枪的末端，并轻微旋转一下。 把活动杆压下一档。这让枪定下你所要的容量。 把枪头直伸入液体约2-5mm深处。如果深入过深，
载体
供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制 的运载工具。功能：1.运送外源基因高效转入受体 细胞； 2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为 外源基因的扩增或表达提供条件。
载体具备条件
载体的分类
1.自主稳定复制 2.多克隆位点
按来源：质粒、噬菌 体、病毒
3.遗传标记 4.分子量小，插入容量大 5. 细胞内拷贝多 6.安全
昆虫谷胱氨肽-S转移酶基因
pPRO EX-HT载体
体外表达GST蛋白
GST nucleotide sequence and open reading frame (yellow)
GGCACGAGGCAACAAAATGGCCAAGAAACTACATTATTTCCATTTGAACGGGCTTGC TGAGTCCATCAGGTACATCCTGCACTACGGCGGACAAAAGTTCGAGGATGTCAGATA CGATCTGAAAAGCTGGCCCATCAAGAGTGTGAAAGACACTCTCCCATACGGCCAGCT GCCACTCTACGAGGAGGGAAATAAGACCCTAAACCAGTCACTGGCCATCGCGCGCTA CGTAGCTGCCCAGGTCCACCTCCTGCCCACCGATCCCTGGGAGCAGGCCGTCCTGGA TGCCATCGTCTTCAACATCTATGACTTCTGGGGAAAGATTCTGGTCTTCATCAAGGA GAATGATGCTGCTAAGAAGGAGGTAATCAAGAAGGAGATCATAAACGAATCCGTTGA CTTCTTCTTCTCCCGATTTGAGAAGGAACTTAAGGCCAACAAGGGATTCTTCAACGG AAAGCTGAGCTGGGCTGACTTCGTCCTTGTGGGCATCGTCGAGTCTGCAAACCTGTN CCTTGGCACCGAGATTGAGAAGAAATACCCCACCGTGCTCGTGCTCGTCCAGAAAAT CGCACCCTCCCTGGAGTGAAGGANTCATCGCGACTAGGAAACCATATGCTCTATAAA TAAAGTACACGTACTGTAAAAAAAAAAAAAA
进入吸头内；否则，可使吸入体积减少。
移液器的校正
在25℃时，水的密度大约为1g/ml （mg/ul）. 如要校正2-20ul 移液器，取10和20ul水于分析天平上分别
称三次。 如要校正20-200ul 移液器，测量100和200ul的水。 如要校正100-1000ul 移液器，测量500和1000ul的水。 如果你的移液器误差超过了5%，请通知老师。
BamHⅠ：
BglⅡ：
目的基因
cDNA：complementary DNA 经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。
基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
目前获取目的基因的几种途径或来源
1. 化学合成法R(从mRNA合成cDNA ) 4. 从染色体DNA中分离
主要归结在表达载体的选择上。
一个合格表达载体的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生 物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用
3. 黏性质粒（cosmid） 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。
表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核 糖体的基因序列组成了表达型载体。
不同类型载体容量
质粒pUC19的分子结构
①
③
②
④
重组DNA技术的基本流程
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达
操作方便、快捷，需时较短，表达量大， 适合工业化生产
大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：
①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA ② 由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进 行糖基化修饰 ③ 表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处 理 ④ 很难表达大量的可溶性蛋白。
实验流程
Part IV： 蛋白表达载体的构建
克隆基因的表达体系
1．原核表达体系
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核 表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制； 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
实验一 融合蛋白表达载体构建 的设计与质粒提取与分析
实验一、融合蛋白表达载体构建的设计 与质粒提取分析
第一部分：分子实验相关知识
Part I： 实验课有关要求及注意事项 Part II： 分子生物学实验有关基础操作 Part III：基因克隆的原理 Part IV： 蛋白表达载体的构建
第二部分：质粒DNA的提取及定量分析
将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差。 让活动杆慢慢地回到原始位置。否者，过快产生的
气雾将污染枪管和你的溶液。 让枪头在液中停一会，以便使液体完全进入枪头。
如果枪头从液中移开太快，可能会有空气在枪头中。 应目测是否有气泡或者所取的量是否符合你的要求。 把枪头贴在液面附近的管壁或管底，然后把液体 放出。须检查是否还有液体在枪头中，如是，慢慢 把液体放入管中。 把枪头去掉，扭回最大量程处。
移液操作tips
吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告 老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新 的头。
检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置 15 秒，观察 是否有液滴缓慢 的流出。若有流出，说明有漏气现象。
严禁吸液后将移液器平放！ 对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢
Part I： 质粒DNA提取的原理 Part II： 方法步骤 Part III： 结果与分析
分子生物学实验室一般安全知识
不能在实验室吸烟，或吃喝东西。 当使用危险或潜在危险物质时，请穿上工作服，戴上手套，
保护眼镜和口罩。 请记住，使用EB，酚等危险物质时，必须戴手套， 并且应
该经常水洗手套的外围，以免污染仪器等。当你离开实验 室时，务必脱掉手套方可离去。使用同位素及酚时，建议 戴两层手套。 废物的处理：废液，强酸及强碱（须稀释）等液体可以倒 入水槽，并放水冲走。废纸等固体废物应倒入垃圾桶。废 弃的微生物以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶 内以备消毒，培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作 普通物品处理。同位素实验的废液及物品，则分别倒在同 位素室里指定的容器里。EB胶倒在指定桶内。酚及氯仿及 盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内。破碎的玻璃 制品必须倒在特定的桶内。
离心管的使用
手持离心管时注意不要触碰离心管内表面， 包括盖子内表面
实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。
混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容 物收集至管底后再进行下步的实验。
实验过程中应做好每个样品的标记工作，且 一般在离心管上用记号笔作标记时，应在两 处重复做好标记。
基因克隆（DNA重组）
如化学物品溅到皮肤等，应马上用水冲洗。如轻微割伤并 没感染的话，可用红十字药盒里的止血贴，否则，马上送 医院。任何事故应马上报告老师。
量程：
0.5～10μl (读数窗显示0.5～10.0,精度为0.1μl) 5～50μl (读数窗显示5.0～50.0, 精度为0.5μl) 20～200μl (读数窗显示20～200, 精度为1μl) 100～1000μl (读数窗显示100～1000, 精度为5μl)
克隆基因的表达体系
2．真核表达体系
与原核表达体系比较，真核表达体系如酵 母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示 了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞， 不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真 核基因组DNA
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑， 比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达 产物的纯化方法等等。
工具酶
工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基 形成二酯键 a.合成cDNA的第二条链b.缺口平移c.测序d.补平 合成cDNA 催化多聚核苷酸5‘羟基末端磷酸化 同聚物加尾 切除末端磷酸基
表达导致质粒稳定性下降