第四章 核酸操作的基本原理
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第四章 核酸操作的基本技术
第一节 核酸的提取与纯化
制取核酸样品的根本要求是保持核酸 的完整性
防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏
一、DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、
氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA
在低电压(5v/cm)时, 迁移速率与电压成正比
5、嵌入染料
溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
pH 影响DNA分子所带的电荷 (TAE TBE)
二、琼脂糖变性胶电泳
未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相 关性
在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对 分子量对数成正比。
2. 琼脂糖凝胶电泳法
核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极 的方向迁移
在一的电场强度下，DNA分子的电泳迁移 率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成
的络合物 在紫外光照射下能发 射荧光，荧光的强度与DNA的含 量成正比。
因此可十分敏感而方便地检 测出凝胶介质中 DNA 。
5.水抽提法
• 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液 除去RNA
• 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一 般不用.
（三）核外 DNA 的提取
核外DNA包括： 质粒DNA
碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法
线粒体DNA 叶绿体DNA
先分离完整的 细胞器
提取纯化原理 与质粒DNA相同。
二、 RNA提取的基本原理与方法
紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法
1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异
吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA 的浓度成正比。
方法：
首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品 用TE或ddH2O为空白对照，在260 nm及280
nm处调节紫外分光光度计读数为0 加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值
2.琼脂糖电泳的影响因素
1、 DNA的分子大小: 迁移速率与DNA分子量对数成反比
2、 琼脂糖浓度 迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 <0.5kb胶浓度是1.2-1.5%, >10kb胶浓度为0.3-0.7%, 两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
SC>OL,L
4、电源电压
（一） 总RNA提取的基本原理与方法 1.总RNA提取的基本原理
RNA分离的关键因素是尽量减少RNA 酶 ( RNase) 的污染
造成RNase酶污的主要来源有 : 所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及
飞沫
玻璃器皿：烘箱中(180℃) 烘烤 8h 以上 , 塑料器皿：
0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate, 二乙基焦 碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤 ; 配置的溶液应尽可能用 0.1% DEPC在37℃处 理12h以上,然后高压灭菌 ; 全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换 ; RNA 电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC处理
根据谱带的形状可反应DNA 的质量
SUCCESS
THANK YOU
2020/2/8
• 同时 , 通过同已知分子质量的 标准 DNA 片段之间的比较 , 还 可测定出随迁移的 DNA 片段的 分子质量。
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2020/2/8
四 核酸的保存
(一)、 影响核酸保存的关键因素 关键的因素是保存液的酸碱度和保存温度。
分离出来
（二）基本步骤
破壁： 破1.液碎氮细研胞磨并对2.D快NA速快加速入实提施取缓保冲护液 变性: 使1.核离子酸变和性蛋剂白、质去的污复剂合2体.酚解、离氯仿 复性: 将1.核无酸水从乙其醇它大2.分异戊子醇中分离出来
（二）、DNA提取的几种方法
浓盐法 SDS法 CTAB法 苯酚抽提法 水抽提法
• 2.总RNA提取的方法
异硫氰酸胍 -氯化铯超速离心法 盐酸胍-有机溶剂法 氯化锂 -尿素法
（二） mRNA 的提取
一般有两条途径： 其一是先提取细胞总 RNA, 然后再从中
分离带 poly(A) 的 mRNA; 其二是先提取多聚核糖体 , 再将蛋白质
与 mRNA 分开。
三、核酸的检测
RNA变性剂有二种，乙二醛-二甲基亚砜（DMSO） 甲醛
三.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
PAGE 为垂直板凝胶电泳
基质： 由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺双体聚合
分辨能力： 其分辨力为为1bp-4kb范围之间的DNA片段 凝胶浓度越大，分辨能力越强
破碎细胞
1.浓盐法
核酸
2.SDS （十二烷基硫酸钠）法
SDS 释放核酸 沉淀蛋白 质及多糖
核酸
上清液
3.CTAB（十二烷基三乙基溴化铵）法
CTAB
与核酸形 成复合物
溶解
沉淀
核酸
沉淀溶于 高盐溶液
4.苯酚抽提法
• 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 • 离心分层后取出水层，多次重复操作， • 合并含DNA 的水相，用乙醇沉淀DNA 。 • 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态
一、电泳的原理
核酸分子是多聚阴离子，在电场中向正极的
方向迁移
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决
于核酸分子本身的大小和构型
1．琼脂糖凝胶电泳（agrose gel electrophisis）
基质： 常熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖
分辨能力： 0.2-50kb 凝胶浓度越大，分辨能力越强
1. 保存液的酸碱度 水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键
2. 保存温度 温度升高会降低核酸的稳定性, 所以
核酸一般都是低温保存。
(二 )、核酸制品的保存方法
• 保存条件
溶液： TE (tris-Hcl EDTA pH8.0)
ddH2O 温度： -70 ℃
一年以上
-20 ℃
半年左右
4℃
数月内
第二节 凝胶电泳技术
。
浓度计算（单位：μg/ml)
双链DNA（ds DNA） =50×OD260×稀释倍数
RNA(ssRNA)浓度 =40× OD260×稀释倍数
单连DNAssDNA =33× OD260×稀释倍数
纯度检测 可通过OD260/ OD280来衡量 OD260/ OD280为1.8左右为好
＞1.8为RNA污染， ＜1.8为蛋白质污染
第一节 核酸的提取与纯化
制取核酸样品的根本要求是保持核酸 的完整性
防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏
一、DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、
氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA
在低电压(5v/cm)时, 迁移速率与电压成正比
5、嵌入染料
溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
pH 影响DNA分子所带的电荷 (TAE TBE)
二、琼脂糖变性胶电泳
未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相 关性
在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对 分子量对数成正比。
2. 琼脂糖凝胶电泳法
核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极 的方向迁移
在一的电场强度下，DNA分子的电泳迁移 率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成
的络合物 在紫外光照射下能发 射荧光，荧光的强度与DNA的含 量成正比。
因此可十分敏感而方便地检 测出凝胶介质中 DNA 。
5.水抽提法
• 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液 除去RNA
• 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一 般不用.
（三）核外 DNA 的提取
核外DNA包括： 质粒DNA
碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法
线粒体DNA 叶绿体DNA
先分离完整的 细胞器
提取纯化原理 与质粒DNA相同。
二、 RNA提取的基本原理与方法
紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法
1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异
吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA 的浓度成正比。
方法：
首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品 用TE或ddH2O为空白对照，在260 nm及280
nm处调节紫外分光光度计读数为0 加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值
2.琼脂糖电泳的影响因素
1、 DNA的分子大小: 迁移速率与DNA分子量对数成反比
2、 琼脂糖浓度 迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 <0.5kb胶浓度是1.2-1.5%, >10kb胶浓度为0.3-0.7%, 两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
SC>OL,L
4、电源电压
（一） 总RNA提取的基本原理与方法 1.总RNA提取的基本原理
RNA分离的关键因素是尽量减少RNA 酶 ( RNase) 的污染
造成RNase酶污的主要来源有 : 所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及
飞沫
玻璃器皿：烘箱中(180℃) 烘烤 8h 以上 , 塑料器皿：
0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate, 二乙基焦 碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤 ; 配置的溶液应尽可能用 0.1% DEPC在37℃处 理12h以上,然后高压灭菌 ; 全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换 ; RNA 电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC处理
根据谱带的形状可反应DNA 的质量
SUCCESS
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2020/2/8
• 同时 , 通过同已知分子质量的 标准 DNA 片段之间的比较 , 还 可测定出随迁移的 DNA 片段的 分子质量。
SUCCESS
THANK YOU
2020/2/8
四 核酸的保存
(一)、 影响核酸保存的关键因素 关键的因素是保存液的酸碱度和保存温度。
分离出来
（二）基本步骤
破壁： 破1.液碎氮细研胞磨并对2.D快NA速快加速入实提施取缓保冲护液 变性: 使1.核离子酸变和性蛋剂白、质去的污复剂合2体.酚解、离氯仿 复性: 将1.核无酸水从乙其醇它大2.分异戊子醇中分离出来
（二）、DNA提取的几种方法
浓盐法 SDS法 CTAB法 苯酚抽提法 水抽提法
• 2.总RNA提取的方法
异硫氰酸胍 -氯化铯超速离心法 盐酸胍-有机溶剂法 氯化锂 -尿素法
（二） mRNA 的提取
一般有两条途径： 其一是先提取细胞总 RNA, 然后再从中
分离带 poly(A) 的 mRNA; 其二是先提取多聚核糖体 , 再将蛋白质
与 mRNA 分开。
三、核酸的检测
RNA变性剂有二种，乙二醛-二甲基亚砜（DMSO） 甲醛
三.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
PAGE 为垂直板凝胶电泳
基质： 由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺双体聚合
分辨能力： 其分辨力为为1bp-4kb范围之间的DNA片段 凝胶浓度越大，分辨能力越强
破碎细胞
1.浓盐法
核酸
2.SDS （十二烷基硫酸钠）法
SDS 释放核酸 沉淀蛋白 质及多糖
核酸
上清液
3.CTAB（十二烷基三乙基溴化铵）法
CTAB
与核酸形 成复合物
溶解
沉淀
核酸
沉淀溶于 高盐溶液
4.苯酚抽提法
• 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 • 离心分层后取出水层，多次重复操作， • 合并含DNA 的水相，用乙醇沉淀DNA 。 • 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态
一、电泳的原理
核酸分子是多聚阴离子，在电场中向正极的
方向迁移
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决
于核酸分子本身的大小和构型
1．琼脂糖凝胶电泳（agrose gel electrophisis）
基质： 常熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖
分辨能力： 0.2-50kb 凝胶浓度越大，分辨能力越强
1. 保存液的酸碱度 水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键
2. 保存温度 温度升高会降低核酸的稳定性, 所以
核酸一般都是低温保存。
(二 )、核酸制品的保存方法
• 保存条件
溶液： TE (tris-Hcl EDTA pH8.0)
ddH2O 温度： -70 ℃
一年以上
-20 ℃
半年左右
4℃
数月内
第二节 凝胶电泳技术
。
浓度计算（单位：μg/ml)
双链DNA（ds DNA） =50×OD260×稀释倍数
RNA(ssRNA)浓度 =40× OD260×稀释倍数
单连DNAssDNA =33× OD260×稀释倍数
纯度检测 可通过OD260/ OD280来衡量 OD260/ OD280为1.8左右为好
＞1.8为RNA污染， ＜1.8为蛋白质污染