猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化

胞密度约为 4×105 个/cm2， 弃去培养基，用 PBS 缓冲液洗涤三次，以去除残留 培养基。 每孔加入 200μL 病毒液，5%CO2 培养箱中 37°C 吸附 1h，弃去病毒液，补加维持液（不含血清的 DMEM 培养基 ）2mL，胰 酶 浓 度 为 5μg/mL，每 板 留 一孔不接毒只更换维持液作为空白对照， 接毒后置 于 5%CO2 培养箱中 37°C 进行培养， 每隔 12h 观察 细胞病变情况，同时收取每孔的细胞培养上清，3000 rpm 离心 5min 后放入-20°C 保存，至接毒后 72h。 最 后收取空白对照孔细胞培养上清，上清样冻融后，按 照 Reed-Muench 法计算 TCID ／ 0.1mL。
（5）PEDV 在 10L 转瓶中增殖试验。 根据在 6 孔板中探索的最优条件，接毒后 10L 转瓶的维持液 体积为 1000mL。共接毒 3 个 10L 转瓶，接毒后每隔 12h 收 取 细 胞 培 养 上 清 ，3000rpm 离 心 5min 后 放 入-25℃保存，直至接毒后 72h，上清样品冻融后，按 照按 Reed-Muench 法计算 TCID ／ 0.1mL。 2 结果 2.1 六孔板病毒增殖试验结果
代当 Husbandry Animal Modern 业殖养禽畜
图 1 接毒前后 Vero 细胞的形态观察
（2）六孔板中病毒增殖试验结果。 接毒后采取的 细胞培养上清进行毒价检测，结果见表 1。 在接毒后 60h 病毒增殖滴度达到峰值 1×106.3TCID50/0.1mL， 空白对照无病变。 峰值可维持 12h、72h 以后病毒效 价略有下降。
当代 畜禽养殖业 Modern Animal Husbandry
科学研究
组稿 \Email: nmgxmy2008@
猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化
王 琳 邢育钢 李继昌 东北农业大学动物医学学院 150030
摘 要 ： 通 过 研 究 猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 （PEDV） 疫 苗 株在 Vero 细胞中的繁殖规律， 确定最佳的增殖条 件。 将猪流行性腹泻病毒疫苗株分别在六孔板、10L 转瓶培养的 Vero 细胞中增殖试验， 培养过程中检 测不同接毒量及接毒后不 同时间点病 毒 TCID50， 以确定 PEDV 疫苗株的增殖规律。 结果显示，在已 确定病毒增殖的最佳条件下，PEDV 疫苗株在逐级 放大的不同培养体系中均能获得较高而稳定的增 殖， 不同体系中病毒增殖均能达到 106.3TCID50/ 0.1mL 以上。
（1）细 胞 病 变 情 况 。接 毒 后 每 隔 12h 观 察 细 胞 病 变 ，发 现 接 毒 后 18h 少 数 细 胞 病 变 ，24h 后 细 胞 出现明显病变，细胞肿胀变圆，折光性增加，颗粒 物质增多，培养后期出现细胞脱落。
2014.11 3
科学研究
组稿 \Email: nmgxmy2008@
表 1 六 孔 板 屮 接 毒 Vero 细 胞 后 不 同 时 间 点 病 毒 滴 度（TCID50/ 0.1mL)
图 3 不同浓度胰酶条件下病毒增殖的 TCID50 检测结果
2.2 PEDV 在 10L 转瓶中增殖试验结果 对 3 个 10L 转瓶中 Vero 细胞的接毒试验样品
进行病毒效价检测，结果见图 4。 接毒后 12h 即可 检测到 病毒效价，随 时间延长逐 渐上升，在 60h 能 达到最高，且峰值可以维持到 72h,之后开始下降。
（3）接毒量对病毒在 Vero 细胞中增殖的影响结 果。 对保存的 10L 转瓶中 Vero 细胞接毒样品进行 TCID50 检测，空白对照组无病变，其余各组检测结果 见图 2。 接毒量 MOI 为 0.1、1 时病毒均能获得较好的 增 殖 ， 病 毒 效 价 峰 值 均 可 以 达 到 1×106.5TCID50/ 0.1mL，而当接毒量小于 0.1 时，病毒的感染量较低，效 价上升速度慢，最终未能达到峰值。
本试验在确定最佳胰酶终浓度时发现， 该疫 苗株 在 Vero 细胞大规 模增殖过 程中，胰 酶 的 加 入 是必不可少的。 同时在对加入不同胰酶浓度进行 比较中发现，在浓度为 5~7.5μg ／ mL 范围内病毒增 殖 速 度 随 胰 酶 浓 度 的 增 加 上 升 。 这 是 因 为 PEDV 毒株不同而引起对胰酶的敏感性有所差异。 另外 不 同 代 次 Vero 细 胞 对 病 毒 增 殖 的 敏 感 性 不 同 也 是引起病毒增殖对胰酶依赖性不同的重要因素。 参考文献： [1]徐国栋,李 峰,张广峰.国内猪流行性腹泻防治概 况.畜牧与兽医，2011，43: 88-93. [2]张世忠,江 斌. 2011 年福建省猪流行性腹泻的流行 特点及其防治措施.福建畜牧兽医，2012，34: 23-25. [3]李 龙.仔猪流行性腹泻的最新流行情况.养猪，2011，（5）: 87-88.
关键词：猪流行性腹泻病毒；Vero 培养；疫苗 本实验对猪流行性腹泻病毒疫苗株在 Vero 细 胞中的增殖规律进行了进一步探索，以获得该疫苗 株增殖的最佳条件，从而为猪流行性腹泻病毒细胞 疫苗的研究奠定基础。 1 材料与方法 （1）毒株。 猪流行性腹泻病毒疫苗株（CV777） 由本单位提供。 病毒粒子浓度为 5×l08PFU/mL。 （2）主要试剂。DMEM 培养基购自 Gibco 公司， 进口胎牛血清购自 Hyclone， 胰酶购自 Washington 公司。 （3）细胞及传代培养。 Vero 细胞来自哈尔滨兽 医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验 室传至 130 代，已经适应在本实验室的培养基中生 长。 满瓶的 Vero 细胞用 0.25%胰酶-EDTA 消化脱 壁后， 用 10%DMEM 培养基 （含 10%进口胎牛血 清）终止消化并稀释到 2～3×105 个/mL，在 10L 转瓶 （内壁表面积约为 4000cm2)中加入培养基 1000mL， 细 胞 重 新 贴 壁 以 后 密 度 约 为 5 ～6 ×104 个/cm2， 在 37℃恒温中，转瓶机釆用 12 转/h 培养 72h，细 胞 长 成 单 层 以 后 密 度 约 为 4 ×l05 个 /cm2， 用 于 接 毒 或 传代。 （4）PEDV 在六孔板培养体系中的繁殖试验。 取 长满 Vero 细胞的 六孔板（每孔 直径为 3.5cm，表面 积为 9.5cm2) 两块 （做两组平行对照， 分别标记为
接毒量对病毒在 Vero 细胞中增殖的影响。 在 最佳 TPCK 胰酶浓度条件下，分为 4 个不同接毒剂 量组，分别病毒粒子浓度为 5×108PFU/mL 的病毒， MOI 分别为 1、0.1、0.01、0.001 每个接毒剂量设置 2 个平行对照组，设 1 组只更换维持液无病毒的空白 对照，比较各组结果，以确定最佳接毒剂量。
TPCK 胰酶浓度对病毒在 Vero 细胞中增殖的 影响。 按照 1.4 步骤中摸索的初步条件，分别在接毒 后加入 TPCK-胰酶终浓度为 1μg/mL、2μg/mL、5μg /mL、7.5μg /mL、10μg /mL 和不加胰酶 6 组接毒试 验，每组做 2 组平行。 比较各组结果，以确定 TPCK胰酶对病毒在 Vero 细胞中增殖的最佳浓度。
图 4 PEDV 在 10L 转瓶中增殖试验结果
3 讨论 本试验对 PEDV 疫苗株在 6 孔板和 10 L 转瓶
大规模增殖的条件进行了研究，在比较试验结果后 确 定 胰 酶 终 浓 度 为 7.5μg ／ mL 作 为 该 疫 苗 株 大 规 模增殖的最佳浓度； 最佳接毒剂量选择 MOI=1，在 此 条 件 下 病 毒 增 殖 最 高 毒 价 均 可 以 达 到 106.0/ 0.1mL 以 上 ， 充 分 说 明 该 疫 苗 株 具 有 高 度 适 应 在 Vero 细胞大规模增殖的特性，为该疫苗株应用于大 规模生产提供了依据。
图 2 不同接毒量对病毒在 Vero 细胞中增殖结果
（4）胰 酶 浓 度 对 病 毒 在 Vero 细 胞 中 増 殖 影 响 的结果。 对加入不同浓度胰酶条件下病毒增殖检测 结果见图 3。 当胰酶浓度低于 5μg/mL，病毒增殖速 度明显减慢， 毒价未能达到峰值， 当胰酶浓度为 7.5μg/mL 时，病毒增殖较稳定，毒价能达到峰值。 当 胰酶浓度达到 10μg/mL 时， 细胞很快在 3~4h 内被 胰酶消化脱落，因此病毒无法增殖，表明该疫苗株 在 Vero 细胞中增值的最佳胰酶浓度为 7.5μg/mL。 4 2014.11