课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能
共聚焦激光扫描荧光显微镜简介以及原理ppt课件
物镜
30
谢谢！
31
27
• 通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴 重叠就可形成一个完整的三维图象
28
• 切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径 影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定 为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。
29
光电倍增管 扫瞄装置
共焦针孔
空气冷却氩激光器
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
4
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重 荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重 叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
6
• Nikon的 Eclipse C1 Plus
7
• 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60x ， 100x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 • 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。 • 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共焦显微镜是在传统光学显微镜的基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，通过计算机对被观察物体进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。
光学成像的分辨率提高了30%～40%。
荧光探针被紫外线或可见光激发，以获得细胞或组织内部微观结构的荧光图像。
在亚细胞水平上观察生理信号和细胞形态的变化。
它已成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域的新一代研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（lscm）的原理就基本原理而言，共焦显微镜是一种现代光学显微镜。
对普通光学显微镜进行了以下技术改进：1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1.2利用共焦技术，在物镜的焦平面上放置一个带小孔的挡板，以阻挡焦平面外的杂散光，消除球差；并进一步消除色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1.4用计算机采集和处理光信号，用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ｌｓｃｍ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2lscm在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ｌｓｃｍ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ｐｈ、微分干涉差显微镜(ｄｉｃ等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光号,并利用光电倍增管放大号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的号放大,灵敏度提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用现在,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够代替以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作良好的经常利用光学显微镜的有机组合,如颠倒光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等,因此被称为万能显微镜,通过它所获得的精密图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理激光扫描共聚焦荧光显微镜原理一、概述激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）是一种高分辨率、高灵敏度的生物成像技术，它通过激光和荧光探针相互作用，实现对生物样品的高清晰成像。
本文将详细介绍LSCM的原理。
二、激发荧光信号的原理LSCM是基于荧光成像技术的，因此了解荧光信号的产生机制非常重要。
在LSCM中，通常使用的探针为有机染料或蛋白质标记物。
这些探针受到激发波长（通常为紫外线或蓝色激光）后会被“激发”到一个高能态，并在短时间内返回基态时释放出能量，即产生荧光信号。
三、扫描共聚焦显微镜系统结构1. 激光器：LSCM中通常使用的激光器为氩离子激光器和氦氖激光器。
它们可以提供不同波长的激发波长，以满足不同探针的需求。
2. 光学系统：光学系统包括激光束聚焦、激光扫描和探测系统。
其中，激光束聚焦是将激光束聚焦到样品上的过程，通常使用的是物镜；激光扫描是将激光束在样品表面移动的过程，通常使用的是振镜；探测系统用于收集荧光信号，并将其转化为数字信号。
3. 样品台和样品固定装置：样品台用于放置样品，通常可以进行XYZ三向移动。
样品固定装置可以确保样品不会在成像过程中移动或震动。
4. 计算机：计算机用于控制整个系统，并处理、分析和显示成像数据。
四、扫描共聚焦显微镜成像原理1. 感应体积：感应体积是指在LSCM中能够产生荧光信号的三维区域。
它由两个因素决定：一个是物镜的数值孔径（NA），另一个是激发波长。
感应体积越小，则分辨率越高。
2. 扫描方式：LSCM采用的是点扫描或线扫描方式。
点扫描方式是将激光束聚焦到样品上的一个点，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕；线扫描方式是将激光束聚焦成一条线，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕。
3. 探测方式：LSCM采用的是共聚焦探测方式。
共聚焦探测可以减少背景信号和散射信号的干扰，提高成像信噪比。
五、LSCM应用LSCM广泛应用于生物学研究中，如细胞生物学、神经科学、分子生物学等领域。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档
思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分 离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名 为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、 伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对 物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内 有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
细胞膜流动性研究
总结词
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
神经元突起研究
总结词 详细描述
细胞骨架结构研究
总结词
详细描述
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜的未 来发展与挑战
技术创新与改进
分辨率提升 高速成像 多维成像
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
确的依据。
药物研发
利用激光扫描共聚焦显微镜观察 药物对细胞的作用和影响，为新
药研发提供实验支持。
生物科学研究
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 生物科学研究，探索细胞和分子
层面的生命活动规律。
实验伦理与法规
动物实验伦理 数据处理与隐私保护 法规遵循
WATCHING
激光扫描共聚焦显微 镜教学课件
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜实验技术 • 激光扫描共聚焦显微镜实验案例 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与挑战
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜简介
定义与特点
定义 特点
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑；
01
样品选择
02 样品预处理
03 载玻片准备
显微镜设置
光源选择
物镜选择
滤色片配置 扫描速度与分辨率设置
图像采集
校准
。
采集参数设置
多区域采集 实时预览
数据分析
图像处理
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
--基本原理及实例应用
李真 西7-103 2015-10
一种观察工具，需要前面的实验做基础
免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染……
什么是LSCM 用来做什么
它和荧光显微镜的关系？ 它和电子显微分
显微镜（Microscope）
泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物 品之影像放大 ,而能被观察的工具。
XYZ扫描 XYT扫描
胚胎的结构
切片分层叠加
单层面扫描
多层叠加
耳蜗基底膜
三 维 图 像 重 建
三 维 图 像 重 建
激光共聚焦显微镜的功能
✓ 使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。 ✓ 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标
记蛋白的表达量成正相关。 ✓ 同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过
优势
局限
高垂直分辨率
沿Z轴逐层扫描，经过计算机处理成为 三维图像。
高水平分辨率
• 人眼分辨率：0.20 mm • 光学显微镜分辨率：0.25 mm • 共焦显微镜分辨率：0.18 mm • 电子显微镜分辨率： 0.20 nm
共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是0.15 mm，轴向分辨率 0.5 mm。
扫描
移动激光扫描器，逐点扫描
不在焦平面 的发射光
分光镜
物镜 激发光线
/theory/
荧光显微镜系统
一 次 性成 成像 像技
术 ，
CCD
X光机
样品
断层扫描技术， 逐点逐行扫描成像
CT机
激光扫描共聚焦系统
特点： 侧面有扫描器接口； 装有微量步进马达； 装有防振动装置； 装有光路转换装置； 配高数值孔径的物镜。
激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM
--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检 测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描， 以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。
光源 光学原理 成像原理 基于的平台
激光 针孔的共轭聚焦技术
断层扫描 荧光显微镜系统
比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析。
普通荧光显微镜
激光共聚焦显微镜
荧光显微镜 目镜或CCD—真彩色
所见即所得 单通道荧光采集
激光共聚焦
PMT检测器—伪彩色
灵敏度高
光信号-电信号-图像 由计算机精确控制图像的合成和输出，
同时电信号增加放大倍数。
多通道荧光采集
一般3个荧光通道和一个透射光通道，分 别成像
荧光显微镜 VS 激光共聚焦显微镜 基于的平台—获取图像方式
• 荧光显微镜
光源
• 汞灯 • 卤素灯 • 其他普通光源
• 激发波长范围广
特点
• 激光共聚焦显微镜
• 激光 光源
特点
•光色纯 •方向性好 •能量可调
检测器
分光镜 物镜
光源
标本
荧光显微镜
检测针孔
光源针孔
激光共聚焦扫描显微镜
点光源
位于焦平面 的发射光
激光器
双针孔 光源针孔、检测针孔
共轭聚焦 双针孔共用物镜的焦点
通道同时探测。
海 马 D G 区
牛精子
藤黄微球菌
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
绿色：活菌 红色：死菌
拟南芥，By Heiti Paves, Centre of Excellence ENVIRON, Estonia 斑马鱼神经元系统， by Albert Pan， Harvard University 视网膜烟花，by Josh R. Sanes, Harvard University
目镜
物镜
光阑和聚光器 聚焦旋钮 光源
载物台
用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。
照相装置
基本原理
分光镜 (长通短反)
物镜
标记了荧光的样品
光源（汞灯）
高压汞灯
滤镜分光
紫外、蓝、绿
激发
被荧光探针染 色的生物样本
光学成像
被标记结构的 荧光光学图像
共聚焦显微镜成像
针孔（pinhole）
标本
物镜
焦平面
伪彩色
--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚 焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片 的荧光显微镜系统。
将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术 结合在一起的高技术设备。
激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/ 图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。
激光共聚焦显微镜的功能
在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，
并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。
ZOOM成像
尽量使
用高数
值孔径 油镜！
激光共聚焦显微镜的功能
通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度， 可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。 并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立 体图像。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消 除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟
1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显 微镜
目前常见的激光共聚焦显微镜
激光光源
荧光 显微镜系统
扫描器系统
计算机图像存 储与处理系统
Zeiss LSM-710 Confocal System
展现最清晰成像细节
By George von Dassow, University of Oregon
高清晰成像
小 鼠 神 经 元 细 胞
激光共聚焦显微镜的功能
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多 种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。
激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多
第二部分
薄层光学切片
多通道同时扫描 ZOOM成像 多维度成像 荧光定量分析 ……
激光共聚焦显微镜的功能
使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，
减少了成像的干扰。
使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可
达普通光学显微镜的1.4倍。
逐点扫描，形成光学切片
展现最清晰成像细节
牛 肺 上 皮 细 胞
观测厚度（60X）：50-100 mm
一次只获得某一层面的图像信 息
共聚焦显微镜是逐点成像，成 像速度较慢
1957年，Marvin Minsky在他的专利中首次阐明了激光扫 描共聚焦显微镜技术的基本工作原理
1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了 一个光学横断面
1970年， Sheppard 和Wilson推出第一台单光束共聚焦激 光扫描显微镜问世