激光共聚焦显微镜技术1讲解
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，它具有优异的成像能力和深度探测能力。
它的工作原理基于激光光源和共聚焦技术，可以对样品进行非破坏性的三维成像和表面拓扑分析。
本文将简要介绍激光共聚焦显微镜的工作原理。
1. 激光光源激光共聚焦显微镜使用一束强度稳定、单色、相干性好的激光光源。
常用的激光光源包括氩离子激光器、氦氖激光器和二极管激光器等。
激光光源通过准直器和聚焦镜系统聚焦成一束准直的、直径极小的激光光斑。
2. 共聚焦技术激光共聚焦显微镜采用共聚焦技术，即通过聚焦光斑和探测光斑的重叠来实现高分辨率成像。
聚焦光斑从样品的一个点与探测光斑重叠之后，仅有从这个点散射回来的光能够通过探测光斑，其他来自样品其他区域的光则被阻隔掉。
这样可以消除样品其他区域的散射光对图像质量的影响。
3. 共焦平面激光共聚焦显微镜通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度的共焦平面。
共焦平面是指光路中聚焦光斑和探测光斑达到最小的位置。
在共焦平面之上和之下，成像出的图像将会出现模糊和散焦现象。
调节聚焦镜的位置，可以实现在样品不同深度层面进行三维成像。
4. 探测和成像聚焦光斑扫描样品上的一个区域，样品上的荧光探针或反射光信号通过物镜收集到探测器上。
激光共聚焦显微镜常用荧光探针来标记样品的特定结构或分子，使其发出荧光信号，进而获得一幅高对比度的荧光图像。
探测器接收到的信号经过放大、滤波和转换等处理后，最终形成图像。
5. 高分辨率成像激光共聚焦显微镜具有高分辨率的成像能力。
其分辨率可以达到光学显微镜的两倍，约为200纳米级别。
激光光源的单色性和相干性，以及共聚焦技术的应用，使得激光共聚焦显微镜能够获得更清晰、更准确的显微图像。
总结起来，激光共聚焦显微镜利用激光光源以及共聚焦技术，能够实现高分辨率的三维显微成像。
通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度层面的图像，更好地观察样品的内部结构。
激光共聚焦显微镜要点解析(一)
激光共聚焦显微镜要点解析（一）激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
一、基本原理和功能1.1 基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
1.2 激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1）“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。
例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。
如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。
荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
激光共聚焦荧光显微镜原理(一)
激光共聚焦荧光显微镜原理(一)激光共聚焦荧光显微镜介绍•激光共聚焦荧光显微镜是一种高分辨率、高灵敏度、非接触式的三维显微成像技术。
•它通过聚焦激光束扫描样品，利用荧光标记来获得样品内部的高分辨率三维图像。
原理解释•激光共聚焦荧光显微镜的主要组成部分包括激光源、物镜、探测器和扫描镜等。
•激光源向物镜聚焦光束，然后通过扫描镜快速扫描，即可在样品中聚焦出一个非常小的点，称为焦斑。
•接着，利用荧光标记，样品发出荧光信号，荧光信号被探测器接收，并转换为电信号。
•然后，将探测到的信号与扫描镜的位置信息对应起来，就可以获得高分辨率而具有三维信息的样品图像。
应用领域•激光共聚焦荧光显微镜广泛应用于生物学、材料学、纳米技术等领域。
•生物学领域中，可用于观察细胞、组织等生物标本的三维结构。
•材料学领域中，可用于研究材料的三维结构和成分。
•纳米技术领域中，可用于研究纳米材料的结构和制备过程。
总结•激光共聚焦荧光显微镜是一种非常重要的高分辨率三维成像技术，可用于生物学、材料学、纳米技术等领域的研究。
•它利用聚焦激光光束和荧光标记，通过快速扫描样品，获得高分辨率的三维结构信息。
•随着技术的不断发展，相信激光共聚焦荧光显微镜在更多领域的研究中将大有作为。
激光共聚焦荧光显微镜的优点•高分辨率：激光共聚焦荧光显微镜的空间分辨率可达到几十纳米级别，比传统显微镜高出数倍。
•高灵敏度：通过荧光标记，激光共聚焦荧光显微镜可实现单个分子级别的检测。
•非接触式：激光光束非常细，采用非接触式聚焦，对样品不会造成破坏。
•可观察内部结构：激光共聚焦荧光显微镜可观察到样品的内部三维结构，而传统显微镜只能看到表面结构。
激光共聚焦荧光显微镜的发展历程•激光共聚焦荧光显微镜是由德国物理学家斯特凡·海克尔（Stefan Hell）于1994年发明的。
•他通过解决光学限制的方法，将光束在空间局部化，从而实现超分辨率成像。
•2006年，海克尔因发明激光共聚焦荧光显微镜被授予诺贝尔化学奖。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，它可以在三维空间内获取高质量的荧光图像。
相比传统的荧光显微镜，LSCM具有更高的分辨率、更好的对比度和更深的成像深度。
本文将详细介绍LSCM的工作原理。
一、激光共聚焦显微镜基本原理激光共聚焦显微镜是一种基于激光扫描技术的显微镜。
它利用一个激光束通过物镜透镜对样品进行扫描，然后收集反射或荧光信号来生成图像。
与传统的荧光显微镜不同，LSCM可以通过调整扫描参数来控制成像深度，并且可以消除样品中其他平面上信号的干扰，从而提高成像质量。
二、激光共聚焦显微镜组成1. 激光源LSCM使用单色或多色激光作为样品照明源。
常用的激光包括氩离子激光、氦氖激光、二极管激光和固态激光等。
不同的激光波长可以用于不同的荧光染料，以获得最佳成像效果。
2. 扫描系统扫描系统由一个或多个扫描镜和一个控制器组成。
扫描镜可以通过改变角度来控制激光束的位置，从而实现对样品的扫描。
控制器可以调整扫描参数，例如扫描速度、线密度和方向等。
3. 物镜物镜是显微镜中最重要的部分之一。
它决定了成像质量和分辨率。
LSCM通常使用高数值孔径（NA）物镜，以获得更高的分辨率和更好的对比度。
4. 探测器探测器用于收集反射或荧光信号。
常用的探测器包括单个或多个光电倍增管（PMT）和共聚焦探测器（CCD）。
PMT具有高灵敏度和快速响应时间，适用于单点检测。
CCD具有较大的检测区域，适合于大面积成像。
5. 数据处理系统数据处理系统包括图像采集卡、计算机和图像处理软件。
它可以将收集到的信号转换为数字信号，并将其转换为图像。
图像处理软件可以用于增强对比度、去除噪声和三维重建等。
三、激光共聚焦显微镜成像原理1. 激光束聚焦激光束从激光源发出后，经过物镜透镜后，会被聚焦在样品表面上。
由于物镜的高数值孔径，只有一个非常小的体积被照亮。
第一章激光扫描共聚焦显微镜基本结构、特点详述
4) 激光分辨率：250nm 5) 功能：明视场、DIC（微分干涉）
6) 样品最大厚度:
取决于物镜的NA、物镜的工作距离、激光 的穿透力(单光子-- 50 m ；双光子--500 m ) 、 样品的透明度，Z轴的最大移动范围(166m、Zwide)。
待测样品最大厚度约1-2mm。
图像发虚和分辨率降低
Non-Confocal Scan of the Same Cell
3D Reconstruction of Astrocyte by Simulated Fluorescence Process
共聚焦系统
CCD
CONFOCAL
当观察样品稍厚时，普通荧光显微镜接收来自焦
10) 扫描密度:
6464、 128128、 512512、 10241024、 20482048
Zoom×2
Zoom×4
激光扫描共焦显微镜的研究焦点：
荧光染料的开发、细胞的制备方法和电子信号处理能力的 提高。
此外，显微镜研发： 1.连续光谱型 Confocal
2.多光子激光扫描显微镜 (Multiphoton Laser Scanning Microscopy)
利用软件叠合，即可获得重构的三维 立体图像。
小结
* LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色 差，其横向分辨率比普通光镜高，成象聚焦 后焦深小，因此也具有较高纵向分辨率。
* 可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和 荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三 维重建后能得到样品的三维立体结构
形象的称为显微“CT”。
7) 样品最小光切厚度：
Z轴的最小移动步距40nm， Z轴的分辨率为0.35 m
8) 四个荧光通道, 一个透射光通道(非共焦 图像) 注：对未标记的标本，可采集反射光图像。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光共聚焦显微镜工作原理
激光共聚焦显微镜工作原理
激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy, LSCM）是一种常用的高分辨显微成像技术，其工作原理如下：
1. 激光：首先，选择合适波长的激光器产生单色的激光束，常见的波长有488nm（常用于激发荧光染料）和633nm（常用
于激发受体标记染料）等。
2. 激光聚焦：激光通过一系列透镜逐层聚焦，使得激光束的直径变窄，激光的光斑能够更加集中。
透镜组合使光束对准一个平面。
3. 共聚焦点：激光经过透镜后，由于透镜组合以及光路设定，激光束的最终焦点被限制在一个非常小的空间区域内，称为共聚焦点。
共聚焦点是激光在待观察样品中最小的光斑。
4. 扫描：共聚焦点在样品上以二维或三维方式进行扫描。
通常采用高速马达驱动镜片组件，使共聚焦点在样品表面来回扫描。
扫描方式包括线扫描和点扫描等形式。
5. 信号检测：样品中的荧光或反射光经过共聚焦点时产生的光信号由探测器收集，并转换为电信号。
常用探测器包括光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）或光电二极管（photodiode）等。
6. 图像重建：通过对检测到的信号进行处理和计算，可以将扫描到的信号重建成具有空间分辨率的二维或三维图像。
利用激
光聚焦特性和扫描方式，可以获取样品的各种层面和不同方向的断面图像。
总之，激光共聚焦显微镜利用激光束的聚焦特性、样品的扫描和信号的检测，实现了高分辨的光学显微成像。
它可以在样品内实现特定深度的光学切片，提供空间分辨率较高的三维图像。
它在生命科学、材料科学、纳米科学等领域中广泛应用。
激光共聚焦显微镜分析技术
激光共聚焦显微镜分析技术
精确
激光共聚焦显微镜（LSCM）是一种用于观察小型生物样品的先进显微技术，它可以在不损坏样品的情况下实现高分辨率图像。
激光共聚焦显微镜的工作原理是将激光束通过多个激光器，焦距变换棱镜，准直镜和口径镜而将激光束聚至样品上。
激光共聚焦显微镜可以实现多维成像，形成三维立体图像，从而使细胞学家可以清楚地观察到一个单细胞内的复杂结构和特性。
LSCM系统组成
激光共聚焦显微镜（LSCM）由显微镜和激光源组成。
显微镜由立方体成像系统，透镜，棱镜，口径镜和准直镜组成。
立方体成像系统可以分辨和叠加激光束并将其导向棱镜,准直镜，口径镜和样品的组合。
立方体成像系统中的激光束可以发生变化和移动，从而更改样品的位置，聚焦位置和整个显微镜系统的焦距。
准直镜，棱镜和口径镜也可以更改激光束的衍射和偏折，以更改激光束的形状。
准直镜，棱镜和口径镜也可以调节激光束的强度，以调节显微图像的亮度。
激光源。
激光共聚焦扫描显微镜技术
激光共聚焦扫描显微镜技术一、简介激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。
在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。
目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。
本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。
激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。
在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。
二、 L SCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Objective:物镜Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。
最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。
激光共聚焦显微镜技术1讲解
激光共聚焦显微镜技术1讲解激光共聚焦显微镜技术The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1978年，阿姆斯特丹⼤学的G.J.Brakenhoff⾸次展⽰了改善了分辨率的共焦显微镜。
1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第⼀台对荧光标记的材料进⾏光切的共焦显微镜激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。
近⼆⼗年来，从滤⽚型到光谱型，⼈们对共焦⾼分辨率，采集图像快速，技术的改进及应⽤开发不断进⾏，出现了很多新的技术。
如双光⼦，FCS,FLIM ,STED等。
共焦显微镜的优点⼈眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25µm电⼦显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：µm共焦显微镜的优点电⼦显微镜的缺陷：1.只能观察固定样品2.样品制备过程（固定、包埋、切⽚）造成的假象荧光显微镜的缺陷:1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构⾼度重叠。
2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的⼤⼤下降。
3.荧光漂⽩很快，使荧光图像的拍照有困难。
4.如果荧光滤⽚选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。
共焦显微镜的优点共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别2. 具有更⾼的轴向分辨率，并可获取连续光学切⽚激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3. 增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术Fluorescent Microscope vs confocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术扫描⽅式激光扫描共焦显微镜技术原理⼩结:Confocal 利⽤放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来⾃光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平⾯的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
病理学：激光共聚焦实验
实验技术简介：激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。
通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。
因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
主要技术指标：1、共聚焦扫描系统（1）独立双向扫描镜。
可以在正置显微镜和倒置显微镜之间迅速互换。
仪器永久不用校正；可调的计算机控制单共焦针孔、孔径20～600μm（2）光谱扫描区400～850nm（3）单线扫描频率≥2000线/秒（4）图扫描率≥3幅/秒512×512pixels；≥20幅/秒512×32pixels（5）扫描分辨率4096*4096扫描放大1～32X；多方位序列扫描方式；任意形状区域扫描-范围：≥22mm。
（6）光谱斜陡率≤1％（7）透射光检测器用于微分干涉相衬法检验（8）低噪音冷却型光电倍增管（PNT）控测器12bi2、激光装置：具有多通道AOTF（四通道，八谱线），连接四种不同波长的可见光激光可以自动选择激光谱线和功率，具等待功能。
光纤耦合连接低能量激光。
目前使用五激光，八谱线。
Ar 激光发生器（458nm/5mw，476nm/5mw，488nm/20mw，514nm/20mw）-蓝；He/Ne激光发生器（543nm/1.2mw）-绿；He/Ne激光发生器（633nm/10mw，594nm/2mv）-红，紫外激光发生器（405nm/25mv）3、显微镜：DMIRE2倒置电动荧光显微镜，拥有10x，20x，40x干镜以及63x，100x油镜。
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
激光共聚焦显微镜的工作原理1. 介绍激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）是利用扫描光束来获取样本高分辨率图像的一种显微镜技术。
相比传统的常规荧光显微镜，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率、激发光功率更高、能透射更深层的样本，并且能够获取三维图像等优点。
在生物医学研究领域广泛应用于细胞和组织的观察。
激光共聚焦显微镜的工作原理基于荧光显微镜和共聚焦成像原理，通过聚焦光在样本内进行光学切片来获取样本的高分辨率图像。
2. 共聚焦成像原理共聚焦成像是激光共聚焦显微镜的核心原理。
在传统的荧光显微镜中，样本上所有的荧光都被同时激发并捕获，导致成像时无法区分特定深度的信号。
而激光共聚焦显微镜通过点对点扫描样本，只捕获焦点所在深度的信号，从而消除了深度模糊，实现了高分辨率成像。
共聚焦成像的原理基于薄光学切片和探测系统的成像区域选取。
2.1 薄光学切片在激光共聚焦显微镜中，激光通过聚焦镜头（Objective）被聚焦到样本表面或内部的一个点上，样本导致了光的散射、吸收和荧光发射等过程。
这些光经过探测系统（例如物镜、光学滤波器和光电二极管等）的收集和探测后形成图像。
为了实现共聚焦成像，光学系统需要将激光点在样本体内移动，并逐点收集图像。
在样本体内，聚焦的激光通过中心区域（称为焦点）继续向外传播，光线逐渐变得散开。
因此，在一个特定的深度上，只有处于焦点附近的光线才能被聚焦在一个点上。
而离焦点较远的光线则在探测系统中被模糊接收，形成深度模糊的图像。
为了克服深度模糊的问题，激光共聚焦显微镜将样本切成一系列薄的光学切片。
这样，每个切片内的光线都可以在探测系统中被聚焦并形成清晰的图像。
通过逐层扫描样本并获取各个切片的图像，最终可以将这些图像叠加起来，形成具有高分辨率和三维信息的样本成像。
2.2 成像区域选取在共聚焦成像过程中，为了准确地获取样本的某个深度的图像，需要通过镜头和探测系统来选取成像区域。
激光共聚焦技术讲解
模块九激光共聚焦技术1. 实验目的让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM ）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。
2. 实验原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。
激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜基本结构（1）扫描模块扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。
荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。
（2）荧光显微镜系统激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。
（3）常用激光器激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：多谱线Ar 离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm 的蓝绿光；He-Ne 激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm 的紫外光。
（4 ）辅助设备风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
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激光共聚焦显微镜技术The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。
1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史☐80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。
☐近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。
如双光子，FCS,FLIM ,STED等。
共焦显微镜的优点人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25μm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：μm共焦显微镜的优点☐电子显微镜的缺陷：1.只能观察固定样品2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象☐荧光显微镜的缺陷:1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。
2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。
3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。
4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。
共焦显微镜的优点☐共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术☐共焦显微镜与传统显微镜的区别2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3. 增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术Fluorescent Microscope vs confocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术扫描方式激光扫描共焦显微镜技术原理小结:Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。
计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的2al convention confocal d d扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。
激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明。
2.具有照明pinhole和探测pinhole。
3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。
4.具有扫描系统——逐点扫描成像。
5.具有多个（五个）荧光通道，可同时探测多个被标记物。
6.使用AOTF(Acousto-Optical Tunable Filter )进行激光波长和强度的选择，并以极超快速控制激光开和关，从而实现任意形状感兴趣区域扫描的功能,实现了实时快速检测。
7. AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)：更好的减少了激发光对发射荧光的干扰。
8.光谱检测器：任意选择接受光谱的波长和带宽。
AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)AOBS的作用☐特定波长的激发光经过AOBS后发生偏转进入光路☐样品产生的荧光直接通过AOBS到达检测器，而反射回来的激发光经过AOBS后发生偏转不能到达检测器。
☐优点：与传统的二色光分光镜相比，增大了荧光的接受率。
☐更好的阻止了激发光对发射荧光的干扰。
光谱检测器棱镜分光，光谱检测激光扫描共焦显微镜技术☐分辨率1. 光学分辨率只与物镜的数值孔径NA和检测波长有关xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )Confocal: Rxy=0.4λ/NA（0.18 μm )2. 采样分辨率固定物镜倍率下，Zoom相同时，无论采样密度大小，采样面积是固定的。
理论上，固定面积下，采样密度越高，即采样点越多，图像越细腻。
但是，采样密度越高，扫描一幅图像的速度越慢，荧光强度越低，样品也越容易被淬灭。
激光扫描共焦显微镜技术☐图像亮度1.与物镜NA有关。
物镜镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比。
L = NA 2/ M 2 , NA 大小相同，倍率越高，镜像亮度越低2. 与pinhole 大小有关。
M 2 = ( M 1 × M 2) 2Pinhole 大小的选择理论上，最佳Pinhole ＝Airy Disk ＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Pinhole 的大小3. 与激发光强度有关。
4. 与接受发射荧光波长的带宽有关激光扫描共焦显微镜技术☐光切厚度和光切步距光学切片厚度取决于: 物镜的NA 、针孔大小、发射波长等光学切片厚度＝光切步距(Step Size)☐dz=Z 轴的最小移动步距: 40nm ，15 nm ，3 nm理论Z 轴分辨率：dz=0.35μm激光扫描共焦显微镜技术☐样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z 轴的最大移动范围(SP2 166μm 、Z-wide,8mm)(sp5 500/1500 μm, -11mm/2mm,15nm stepsize ）在观察较厚的样品，如脑片时，应该选用怎样的物镜？激光扫描共焦显微镜技术☐技术指标（Leica TCS ) :1. xy 分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )Confocal: Rxy=0.4λ/NA （0.18 μm )2. 样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z 轴的最大移动范围(166μm 、Z-wide 8mm sp2)(500um/1500um/3nm , Z-wide 13mm Sp5) ( 0.88λem)2 ( n ⨯√2 Ph )2 NA n -(n 2-NA 2)1/2 +3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm,SP2）取决于: 物镜的NA、针孔大小、发射波长等Z轴的最小移动步距: 40nmZ轴的分辨率: 0.35 μm激光扫描共焦显微镜技术☐Pinhole（探测针孔）大小影响:1) 图像的亮度2) 光学切片的厚度☐Pinhole大小的选择理论上，最佳Pinhole＝Airy Disk＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Ph的大小。
激光扫描共焦显微镜技术4. 激光器Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nmGreNe : 543nm; HeNe: 633nmAr激光器(UV): 351nm, 361nm固体激光器：561nm,405nm☐激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本延直线传播2) 单色性好:∆λ=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的。
4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合。
5)光谱的不连续性。
激光扫描共焦显微镜技术5. 五个荧光通道, 一个透射光通道即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像，但透射光图像为非共焦图像。
注：对未标记的标本，可采集反射光图像。
激光扫描共焦显微镜技术☐扫描速度:CONVENTIONAL 2800 lines/s 512⨯512 5/S Resonant 16000 lines/s 512⨯512 25/S ☐扫描密度:64⨯64128⨯128512⨯512，512⨯64，512⨯321024⨯10242048⨯2048 SP5 8192 ⨯8192 4096 ⨯4096☐扫描方式：xyz, xyt, xzt, xt，xyzt, xyλ, xλ,xzλ, xzy, xyzλ,激光扫描共焦显微镜技术☐共焦显微镜的类型：1.点(慢)扫描共焦显微镜:分辨率高, 图像清晰; 噪音低; 采集图像速度慢;目镜中观察不到共焦图像2.线(狭缝)扫描共焦显微镜(video rate)分辨率低; 噪音高; 扫描速度快240幅/秒; 目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜性能介于上述两者之间Spinning disk confocalSpinning disk confocalSpinning disk confocal☐•每个视场约1000个激光点，总计约20000个针孔☐•针孔尺寸固定在50μm，适合100x/1.4 油镜☐•针孔间的空隙可避免信号相互干扰☐•约有70%的激发光到达样品☐• 盘转速1500到10000转/秒，成像速度300到2000帧/ 秒☐• 激发光谱400-650nm 检测光谱420-750nmSpinning disk confocal☐采用双转盘,微透镜☐EM CCD 作为探测器☐采样速度快，300－2000/s☐适合于记录活细胞样品的快速变化☐没有电子放大，不适合观察细胞内的微细结构。
☐发射波长使用滤片选择。
激光扫描共焦显微镜技术的应用☐The application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光扫描共焦显微镜技术的应用☐Confocal基本应用☐FRET、FRAP 和FLIP应用☐与Confocal相关技术的进展激光扫描共焦显微镜技术的应用功能.1.多重荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和xt 扫描8.图像处理9. 旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描－光谱拆分☐荧光强度的测量荧光强度＝荧光效率×激发光强度☐测量原理(Boehm 1861)☐I=I0Q(1-10-kcd )＝I0Q(1-1/10kcd )☐I0: 激发光强度；I: 发射光强度☐Q: 荧光量子产率，对于特定荧光物质，该值为常数。