激光扫描共聚焦显微镜技术-0429剖析
激光扫描共聚焦
激光扫描共聚焦显微镜在医学研究中的应用随着科学技术的发展，实验技术已经成为实现实验目的的重要手段，对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。
激光扫描共聚焦显微镜简称共聚焦显微镜，20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，同时也是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一，它由激光，电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段与传统的光学显微镜结合而产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，并在生物及医学等领域的应用越来越广泛，现在已经成为生物医学实验研究的必备工具。
1.激光扫描共聚焦显微镜的结构和原理激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope）是在荧光成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像集中处理，由于该仪器使用紫外光或者可见光激发荧光探针，从而可以清晰观察细胞或者组织内部微细结构，并可反映出亚细胞水平上生理信号的变化在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜出包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源，扫描装置，检测器，计算机系统（包括数据采集，处理，转换及应用软件），图像输出设备，光学装置和共聚焦系统等部分。
由于该仪器具有高分辨率，高灵敏度，光学切片，三维重建，动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。
2.日常管理共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。
其价格昂贵，在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。
通常要做到以下几点：（1）严格按照操作规则使用，避免因使用不当造成损坏。
（2）为保持良好工作状态，延长使用寿命，工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。
每次使用后，要做好清洁工作，及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。
（3）系统应设立专门房间，安装在防震台上，工作间内要安装空调，抽湿及防尘装置。
无论仪器是否工作，最好使其环境始终保持在22 ℃± 1 ℃的恒温。
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共聚焦扫描显微镜原理功能
激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，通过激光光源和共聚焦扫描技术可以实现对样品的三维成像。
该显微镜原理独特，功能丰富，下面将详细介绍。
首先，让我们了解一下激光共聚焦扫描显微镜的工作原理。
激光共聚焦扫描显微镜的激光光源可以产生高能量、单色和高单频的激光束，然后通过一系列光学元件将激光聚焦到一个微细尖端，形成一个极小的焦点。
这个焦点可以对样品进行扫描，通过激光与样品之间的相互作用，得到一系列的反射或荧光信号。
这些信号经过光学系统的分光探测器进行收集与分析，可以获得高分辨率的图像。
1.高分辨率成像：激光共聚焦扫描显微镜的光学系统可以聚焦到亚米级尺寸的焦点，并收集样品表面或内部的成像信号。
相比传统的荧光显微镜具有更高的分辨率。
2.三维成像：激光共聚焦扫描显微镜可以通过扫描激光焦点在样品内部的位置，获取样品的三维信息。
可以使用自动扫描系统，将激光在X、Y、Z三个方向的位置进行扫描，实现高质量的三维成像。
3.荧光探测：激光共聚焦扫描显微镜常用于生物医学等领域的研究，可以通过荧光标记的样品来观察样品的分子组成和生物过程。
荧光探测技术可以提供对细胞和组织结构的高分辨率成像。
4.实时观察：由于激光共聚焦扫描显微镜可以实现高速扫描和数据采集，可以实时观察样品的动态变化。
这使得该技术在生物学和材料科学研究中非常有用。
5.光谱分析：激光共聚焦扫描显微镜可以使用多种光谱探测器来进行荧光信号的分析。
可以通过收集不同波长的荧光信号，获得样品中的各种分子或物质的信息。
6.激光刺激：激光共聚焦扫描显微镜也可以进行激光刺激实验。
通过选择合适的激光波长和功率，可以在细胞或样品的特定区域进行局部刺激。
这对于研究细胞生理和功能是非常重要的。
总之，激光共聚焦扫描显微镜具有高分辨率成像、三维成像、荧光探测、实时观察、光谱分析和激光刺激等功能。
激光共聚焦显微镜分析技术
狭分缝光谱扫描
光谱扫描带宽 精度 2 纳米
滤光片系统 OTE
灵敏度较光谱式差
光学能量转移效率
94%
98% 88.5% 86.7% 90.3% 88.5% 100%
光谱式探头
棱镜分光,狭缝扫描,全无滤片
• 第一优势:提高灵敏度 • 光谱式与滤光片比较： 88% 对 61% • 为了达到相同样品质量 (相同探测发射 能量), 较低OTE 的仪器需要较高激光能 量作为激发以致更大机会做成样品漂白 ，干 扰 PSF, 因此降低图象质量
• Seamless recording of full spectrum
• Up to 4 PMT´s with individual gain adjustments to compensate for emission properties of stains
(PMT=Photomultiplier tube)
激光光源扫描器内装有针孔光栏分光镜发射荧光单色器及检测器荧光显微镜装有微米步进马达系统光学装置计算机图像存储与处理及控制系统
激光共聚焦显微镜技术 第2章
激光扫描共聚焦显微镜的基本结构、 工作原理及基本功能
一 、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构和工作 原理 激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集 和分析的大型精密仪器。其主要由以下几部分组 成:激光光源、扫描器（内装有针孔光栏、分光 镜、发射荧光单色器及检测器)荧光显微镜（装 有微米步进马达）系统、光学装置、计算机图像 存储与处理及控制系统。
Emission Filter Emission Pinhole
Principle of a standard Confocal
Detector
Barrier Filter Fixed characteristics Pinholes
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光扫描共聚焦显微镜分析解析
生物大分子结构和功能研究 免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0 r: 分子间距离
r <2R0
R0: 分子间发生50%能量转移的距离
检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。 应用：检测大分子的相互作用 大分子构象的改变(蛋白) 例：大分子(亚基)的结合与分离 受体与配体的结合 常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
•Confocal 专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技公司。
•奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养
•无菌切取 1~3g 乳腺组织，胶原酶消化法进行乳腺上皮细胞的分离培养 。对胶原酶浓度及消化时间进行优化，确定最适酶浓度为 400U/ml，消 化时间为 3.5 小时。以 1x106个/ml的密度铺于 Confocal 专用细胞培养 皿中，置于 5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，并观察细胞生长情况。 2~3 天更换培养液，观察细胞生长约 80％~90％汇合度时，进行细胞器 荧光检测。
Intense laser Beam Bleaches Fluorescence
五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after %F photobleaching）
Recovery of fluorescence
Time
Zero time
10 seconds
30 seconds
•乳腺上皮细胞主要细胞器的检测
•37℃预热、 终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束进行点扫描，将样品的不同深度处的信息获取并合成，从而实现三维图像的获取。
本文将对激光共聚焦显微镜的原理和应用范围进行详细介绍。
首先是激光扫描。
激光束通过空气透镜和扫描镜反射，聚焦在样品上。
扫描镜以一个固定的频率和幅度来快速振动，使得激光束扫描在样品表面，形成二维扫描像。
其次是共焦原理。
共焦显微镜利用一个空孔径光阑（pinhole）来调整激光束的直径，只允许经过焦平面的光通过，其他散射光被阻挡。
这样可以消除在光路上不同深度处的散射光干扰，提高图像的纵向分辨率。
同时，由于只有通过焦平面的光才能进入探测器，所以可以采集不同深度处的信息，合成三维图像。
最后是探测技术。
通常激光共聚焦显微镜会配备一个光电探测器，并通过探测器来收集散射和荧光光信号。
散射光可以用来形成反射式图像，而荧光光信号则可以用来观察标记了特定分子或细胞的样品。
通过调整激光的波长和探测器的设置，可以实现不同特定分子和结构的成像。
1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以提供高分辨率的细胞和组织成像。
通过荧光标记特定蛋白质或细胞结构，可以观察和研究细胞内部的生物过程和结构。
2.神经科学：激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用得到了广泛关注。
可以观察和追踪神经元的形态和功能，研究神经网络的连接和活动，揭示神经系统的工作机制。
3.生物医学研究：激光共聚焦显微镜在生物医学研究中也扮演着重要的角色。
可以用于癌症细胞的培养和观察，研究癌症的发生和发展机制。
还可以用于研究哺乳动物早期发育过程中的细胞分化和组织形态的变化。
4.材料科学：激光共聚焦显微镜可用于对材料的表面和内部结构进行观察和分析。
可以研究纳米材料的形貌和组成，观察材料的晶体结构和缺陷。
总之，激光共聚焦显微镜是一种重要的显微镜技术，具有高分辨率、三维成像和可观察特定分子和结构的能力。
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微分离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……Conventional fluorescence microscope Confocal microscope历史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987Zeiss 、Leica 、Meridian 、OlympusZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.D. Phase-contrast or adifferential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.常用荧光探针Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激光共聚焦显微镜分析技术
激光共聚焦显微镜分析技术
精确
激光共聚焦显微镜（LSCM）是一种用于观察小型生物样品的先进显微技术，它可以在不损坏样品的情况下实现高分辨率图像。
激光共聚焦显微镜的工作原理是将激光束通过多个激光器，焦距变换棱镜，准直镜和口径镜而将激光束聚至样品上。
激光共聚焦显微镜可以实现多维成像，形成三维立体图像，从而使细胞学家可以清楚地观察到一个单细胞内的复杂结构和特性。
LSCM系统组成
激光共聚焦显微镜（LSCM）由显微镜和激光源组成。
显微镜由立方体成像系统，透镜，棱镜，口径镜和准直镜组成。
立方体成像系统可以分辨和叠加激光束并将其导向棱镜,准直镜，口径镜和样品的组合。
立方体成像系统中的激光束可以发生变化和移动，从而更改样品的位置，聚焦位置和整个显微镜系统的焦距。
准直镜，棱镜和口径镜也可以更改激光束的衍射和偏折，以更改激光束的形状。
准直镜，棱镜和口径镜也可以调节激光束的强度，以调节显微图像的亮度。
激光源。
激光共聚焦扫描显微镜技术
激光共聚焦扫描显微镜技术一、简介激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。
在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。
目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。
本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。
激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。
在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。
二、 L SCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Objective:物镜Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。
最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。
激光共聚焦显微镜分析技术
激光共聚焦显微镜分析技术激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）是一种高分辨率的荧光显微镜技术，可以在细胞和组织水平上观察和研究样本的三维结构和功能。
其原理是利用激光束经过一组物镜后，聚焦于样本的一个点上，再通过探测器收集经过样本的反射或荧光信号，然后通过扫描样本的X、Y和Z轴移动，以获取图像的二维和三维信息。
1.高分辨率：激光共聚焦显微镜使用激光束的聚焦原理，可以获得比传统显微镜更高的分辨率。
它可以减少标记物质的模糊和混叠现象，提供更清晰、更详细的图像。
2.3D成像能力：激光共聚焦显微镜可以获取堆叠图像，从而构建三维结构。
通过扫描样本的Z轴，可以获得不同深度的切片图像，再通过软件进行堆叠和重建，得到三维结构信息。
3.实时观察：激光共聚焦显微镜可以实时观察和记录样本的变化过程。
通过快速的扫描速度和高灵敏度的探测器，可以实现对细胞和组织的实时观察，并捕捉瞬间变化的图像。
4.荧光标记：激光共聚焦显微镜可以应用于荧光标记技术，通过使用特定的荧光染料或标记抗体，可以观察和定位特定蛋白质、细胞器和细胞分子的位置和表达水平。
激光共聚焦显微镜分析技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究、药物发现、神经科学等领域。
它可以提供高分辨率的图像和三维结构信息，帮助研究人员深入理解生物学过程和细胞功能。
以下是几个应用激光共聚焦显微镜的案例：1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以观察和分析细胞和组织的形态、结构和功能。
它可以用于观察细胞分裂、细胞移动、细胞器的定位和交互作用等细胞过程的研究。
2.荧光探针研究：激光共聚焦显微镜可以与特定的荧光染料或标记抗体结合使用，用于研究特定蛋白质或细胞分子的位置和表达水平。
通过荧光标记技术，可以观察和定位蛋白质在细胞内的位置和亚细胞结构。
3.三维结构重建：激光共聚焦显微镜可以通过扫描样本的Z轴，获得不同深度的切片图像，并通过软件进行三维堆叠和重建。
激光扫描共聚焦显微镜的综述
激光扫描共聚焦显微镜的综述基本原理由于生物研究中免疫荧光技术的应用越来越广泛，研究人员发现，当实验室所用的荧光标本稍厚时，该显微照片的分辨率较低，由于传统显微镜技术都使用的是场光源，由于标本层次的重叠结构区别（内部细胞结构）就会产生衍射和散射光的干扰，使标本中的多处细胞结构的成像模糊和发散。
激光共聚焦显微镜的首先主要是利用激光扫描形成的点光源，加上共聚焦原理，在荧光标记标本的焦平面上各个点的处理,光信号穿透探针小孔到达光电倍增管，再经过信号数字图像处理观察、分析和输出，在计算机监视屏上形成图像。
其特点是可以对样品进行断层成像，非侵入的观察三维空间结构。
由于光栅针孔和探针孔对物镜是共轭对称的，焦平面同时聚焦于光栅针孔和探测针孔。
进行点扫描时，逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。
与聚焦光点相应的光源针孔和观察针孔必须对准，故称共聚焦。
这样，大大提高了系统信噪比和成像清晰度。
这种技术对于观察厚的样品显得尤为重要。
传统的免疫荧光显微镜在厚的样品中只能看到表面发出的荧光，LSCM可以深入到样品内部，具体到某一个层面。
20多年来，虽然共聚焦显微镜的扫描方式使得扫描共聚焦显微镜在生物医学领域有了广阔的用武之地。
包括以下几个方面：⑴多波长激光器产生更明亮的点光源。
⑵噪声很低光学检测器⑶效率很高的反射镜。
⑷图像处理大大加快了。
⑸视频显示技术分辨率大大提高。
⑹亮度更大、更稳定的荧光探针激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用1 定量荧光测定LSCM 通过计数接收到的光子，进行多次重复的荧光定量分析，和活细胞定量分析。
LSCM通过这些方法来对单细胞或细胞群的各种细胞器，结构蛋白，核酸，酶和受体分子等特异性结构的含量与分布进行定量分析，同时还可测定膜电位，氧化还原状态等生化反应变化程度。
此外，我们可以用LSCM来完成对细胞内的荧光强度、细胞周长及细胞内颗粒数等参数进行测定。
我们还可以LSCM 可用于细胞骨架装配、细胞凋亡机制、离子通道的装配等多个方面的研究。
共焦显微镜剖析
集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合
激光扫描共焦显微镜技术
5. 四个荧光通道, 一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外 还可以同时采集透射光图像,但透射光 图像为非共焦图像。
•Ca2+浓度确定测量
•1〕单波长公式法
•Fluo3: 530nm Kd=450nM
•[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
•Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2) •Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)
•测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低〔F值不
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示 活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的 构造及病理过程
可用于观看分子的运动〔FRAP〕
蛋白之间的相互作用〔FRET〕
激光扫描共焦显微镜应用
三.动态测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量
1).游离Ca2+测量 检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探
焦点即被探测点，被探测点所在的平面 为共焦平面 4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个〔四个〕 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
激光扫描共焦显微镜技术
• 技术指标〔Leica TCS SP2) :
• 1. xy区分率比传统显微镜小1.4x
• 传统显微镜: Rxy=0.61 /NA 〔0.25 m )
• 定位、定量 • 三维重组 • 动态测量
活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+)
激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）是一种高分辨率的显微镜，它利用激光光源和共聚焦技术，可以获取三维细胞和组织的高质量图像。
在激光共聚焦显微镜中，激光光源通过透镜聚焦到样品表面，激发样品中的荧光物质，然后收集经过样品散射和荧光激发的光信号，通过共聚焦技术得到高分辨率的图像。
下面将详细介绍激光共聚焦显微镜的原理。
首先，激光共聚焦显微镜的激光光源是其核心部件之一。
激光光源通常采用单色激光器，如氩离子激光器、氦氖激光器等，能够提供高强度、单色性好的激光光源。
这种激光光源具有较窄的光谱宽度和较高的光强，能够有效地激发样品中的荧光物质。
其次，激光共聚焦显微镜采用了共聚焦技术，这是其能够获取高分辨率图像的关键。
共聚焦技术通过在样品焦平面上扫描激光光斑，实现了激光光斑和检测光斑的共聚焦，从而消除了样品厚度对成像质量的影响，提高了成像的分辨率。
同时，共聚焦技术还能够减少背景干扰，提高信噪比，使得成像结果更加清晰。
此外，激光共聚焦显微镜还采用了光学放大系统，包括物镜、目镜和透镜等。
物镜是位于样品和检测器之间的光学器件，它起到了光学放大和成像的作用。
目镜是位于检测器和观察者之间的光学器件，它起到了调焦和目视的作用。
透镜则用于对激光光源进行聚焦和收集样品发出的光信号。
这些光学器件配合共聚焦技术，使得激光共聚焦显微镜能够获得高分辨率的三维图像。
最后，激光共聚焦显微镜的成像原理是基于激光共聚焦技术和荧光成像技术的结合。
在样品中存在荧光物质时，激光光源可以激发这些荧光物质发出荧光信号，然后通过共聚焦技术获取样品表面的荧光信号，从而获得高分辨率的三维图像。
这种成像原理使得激光共聚焦显微镜在生物医学、细胞生物学、神经科学等领域具有广泛的应用前景。
总之，激光共聚焦显微镜通过激光光源、共聚焦技术、光学放大系统和荧光成像技术的结合，实现了高分辨率的三维成像。
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Basics of conventional fluorescence microscope
1 水银弧光灯 2 中密度滤片 3 光镧 4 场镧 5 激发滤片 6 分光镜（BSP) 7 物镜 8 样品 9,10 发射滤片 11 目镜
Fluorescent Microscope
Arc Lamp
Excitation Diaphragm-光圈 Excitation Filter
2）、球差： 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光
线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点 的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点 ,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不 清。
3）、色差： 是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜
色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透 镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像 模糊,而且像的边缘尚带有色晕。
3、显微镜成像清晰度的决定因素: 1）.分辨率 2）.球差 3）.色差
1）、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质 点分辨清楚的能力,通眼及各类显微镜的分辨率
人眼分辨率： 光学显微镜分辨率： 共焦显微镜分辨率： 电子显微镜分辨率：
0.20 mm 0.25 mm 0.18 mm 0.20 nm
2、共焦显微镜发展历史
• 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微 镜技术的某些基本原理，获得了美国的专 利
• 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦 显微镜产生了一个光学横断面
• 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光 与被照明物体的原子之间的非线性关系和 激光扫描器的拉曼光谱学
• 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜 大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特 点：需与扫描器连接，使激光能进入显微 镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到 达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与 激光转换，同时汞灯光线强度可调
（3）常用激光器
• 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有 单激光和多激光系统，常用的激光器包括 以下三种类型 :
1
2
2
观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平 面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图 像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生 物学标本是层次区别的重叠结构）。
共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域 被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区 域被照明。
（2）荧光显微镜系统
• 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统 的成像质量。显微镜光路以无限远光学系 统可方便地在其中插人光学选件而不影响 成像质量和测量精度。物镜应选取大数值 孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采 集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片 组的选取，载物台的移动调节，焦平面的 记忆锁定都应由计算机自动控制
• 半导体激光器：405nm（近紫外谱线 • 氩离子激光器：457nm、477nm、488nm
、514nm（蓝绿光 ) • 氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器
）633nm （红光—氦氖红激光器 )
• UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光 )
4）辅助设备
•风冷、水冷冷却系统及稳压电源
Ocular-目镜
Objective
Emission Filter
Confocal Principle
Objective
Laser Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Emission Filter Emission Pinhole
Differences between conventional and confocal microscope 1
从某种意义上讲，共聚焦显微
镜是一种现代化的光学显微镜，它 对传统的光镜从以下几方面作了改 进
• 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台 商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100 ，扫描方式为台阶式扫描
• 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作 生物荧光显微镜的共聚焦系统
• 1987年White和Amos在英国《自然》杂志 发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文 ，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要 工具
4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构
• 激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描 模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号 处理器、计算机以及图像输出设备等
激光共聚焦显微镜构成
显微镜 步进器
激光器 光电倍增管 检测器
计算机 电子图像 软件
（1）扫描模块
• 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片 的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播 方向）、发射荧光分色器（选择一定波长 范围的光进行检测）、检测器（光电倍增 管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫 描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色 器选择后，被分成各单色荧光，分别在不 同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦 图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个 并列的单色荧光图象及其合成图象
Laser Scanning Confocal Microscope
1、普通荧光显微镜的不足
使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的重叠结构）。
基本工作原理
• 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是 首先由激光器发射的一定波长的激发光， 光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光 栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平 面上，样品上相应的被照射点受激发而发 射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检 测器，并成像于计算机监视屏上。这样由 焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成 了一幅完整的共焦图像，称为光切片