激光共聚焦显微镜原理
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come of age”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。
普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别
Βιβλιοθήκη Baidu 激光共聚焦显微镜的基本原理
利用放置在光源后的照明针孔 (P1)和放置在检测器前的探测针 孔(P2)实现点照明和点探测；激 光经过照明针孔形成点光源， 由物镜聚焦在样品焦面的某个 点上，只有该点所发射 的荧光 成像在探测针孔上，该点以外 的任何发射光线被探测器阻挡， 不能到达PMT探测器，从而提 高了成像效果。照明针孔和探 测针孔 共焦，共焦点为被探测 点，被探测点所在的平面为共 焦平面。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜 LSCM LASER SCANNING CONFOCAL MICROSCOPE
以激光作为光源，激光器发出的激光通过照 明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行 光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚 焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后 的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过 透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电 倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的 荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡， 不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧 光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采 用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显 微镜”。
发展历史
1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术 的基本工作原理，
1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜 1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy
分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。
发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测， 不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色 器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。
检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度 可根据强度进行连续调节。
荧光显微镜系统
荧光探针
荧光标记与荧光探针：采用一定的标记物，使样品待测物 质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这 种组样品赋予特征荧光的操作过程称为荧光标记。
荧光探针的种类：蛋白质、单糖和多糖探针，细胞器探针、 核酸探针、细胞活性探针、膜结合受体探针等。
如何选择探针
根据实验目的确定需要检定的指标
受激辐射
激光光源的产生
激光就是受激幅射产生的，激光束里处于相同状态的光子是相干 的，偏振的，并沿同一方向传播的。
激光的特征
单色性好 方向性好 亮度高 相干和偏振性好
激光器：405，440，635，488，559
扫描器系统
针孔：confocal一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源 前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描 成像，排除焦面杂散光起关键作用
计算机系统
数据采集、处理、转换、应用软件
基本功能
多种图像扫描方式
2D: xy，xz，xt 3D：XYZ，Xyt 4D：XYZt 光谱扫描
多色荧光同时检测： 图像分析与定量处理：
3D重建，立体重建，断面轮廓分析。 图像分析：特定区域的强度、周长的测量，以及延时观察分析t等。 荧光光谱拆分
LSCM的基本组成
激光发射器 显微镜部分 扫描装置 计算机系统
基本结构——激光光源
LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受激发射的辐射光放大。
激光光源的产生
受激吸收：处于较低能级的粒子在受到外界的激发（即与其他的粒子发生了有 能量交换的相互作用，如与光子发生非弹性碰撞），吸收了能量时，跃迁到与 此能量相对应的较高能级。
类型：正置，倒置 光路：
光源：汞灯、氙灯，观察分辨样品中产生荧光物质的成分与位 置。 源发滤光片：选择适合荧光物质激发波波长的范围 双色分光镜：初步分开激发和发射光组件、 阻滤片：获得更纯的发射荧光 物镜：激发和发射都由同一物镜实现。 目镜：10 × 用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马 达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。
确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择 应成熟的探针或标记方法。可通过查找文献和试剂公司产品目 录确定可以标记待测物的荧光探针的种类或范围。
考虑荧光探针的特性：荧光探针与样品的反应特性（与待测分 子或离子反应的选择性或专一性等），荧光探针的灵敏度和荧 光强度，荧光探针标记后样品的光谱特征（需要在仪器的检测 范围内），荧光的稳定性，样品中多重荧光的相互影响（避免 光谱交叉）。
免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。 外源性荧光物质进入组织内产生的荧光。某些药物 诱发荧光：生物胺类能与某些醛类物质在一定条件下缩合而发
生荧光。 酶致荧光：某些酶的反应能够发射荧光。
LSCM主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有 特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样 品待测物质具有荧光，然后再进行检测。
组织和细胞中的荧光来源
自发荧光：指组织细胞不经过任何荧光染色便能在短波长光的 激发下发射出的荧光，GFP就具有自发荧光，是标记靶蛋白的 特异性荧光探针。
荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发 出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成 和功能。有些可做活体染色。
自发辐射 ：粒子受到激发而进入的激发态，不是粒子的稳定状态，自发地从高 能级激发态（E2）向低能级（E1）跃迁，同时产生光辐射的过程。 众多原子以 自发辐射发出的光，不具有相位、偏振态、传播方向上的一致，是物理上所说 的非相干光。
受激辐射：除自发辐射外，处于高能级E2上的粒子还可以另一方式跃迁到较低 能级。当一个外来光子带来的能量正好对应能级差时（E2-E1），也会引发粒子 以一定的概率，迅速地从能级E2跃迁到能级E1，同时辐射一个与外来光子频率、 相位、偏振态以及传播方向都相同的光子的过程。
普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别
Βιβλιοθήκη Baidu 激光共聚焦显微镜的基本原理
利用放置在光源后的照明针孔 (P1)和放置在检测器前的探测针 孔(P2)实现点照明和点探测；激 光经过照明针孔形成点光源， 由物镜聚焦在样品焦面的某个 点上，只有该点所发射 的荧光 成像在探测针孔上，该点以外 的任何发射光线被探测器阻挡， 不能到达PMT探测器，从而提 高了成像效果。照明针孔和探 测针孔 共焦，共焦点为被探测 点，被探测点所在的平面为共 焦平面。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜 LSCM LASER SCANNING CONFOCAL MICROSCOPE
以激光作为光源，激光器发出的激光通过照 明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行 光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚 焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后 的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过 透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电 倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的 荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡， 不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧 光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采 用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显 微镜”。
发展历史
1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术 的基本工作原理，
1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜 1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy
分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。
发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测， 不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色 器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。
检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度 可根据强度进行连续调节。
荧光显微镜系统
荧光探针
荧光标记与荧光探针：采用一定的标记物，使样品待测物 质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这 种组样品赋予特征荧光的操作过程称为荧光标记。
荧光探针的种类：蛋白质、单糖和多糖探针，细胞器探针、 核酸探针、细胞活性探针、膜结合受体探针等。
如何选择探针
根据实验目的确定需要检定的指标
受激辐射
激光光源的产生
激光就是受激幅射产生的，激光束里处于相同状态的光子是相干 的，偏振的，并沿同一方向传播的。
激光的特征
单色性好 方向性好 亮度高 相干和偏振性好
激光器：405，440，635，488，559
扫描器系统
针孔：confocal一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源 前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描 成像，排除焦面杂散光起关键作用
计算机系统
数据采集、处理、转换、应用软件
基本功能
多种图像扫描方式
2D: xy，xz，xt 3D：XYZ，Xyt 4D：XYZt 光谱扫描
多色荧光同时检测： 图像分析与定量处理：
3D重建，立体重建，断面轮廓分析。 图像分析：特定区域的强度、周长的测量，以及延时观察分析t等。 荧光光谱拆分
LSCM的基本组成
激光发射器 显微镜部分 扫描装置 计算机系统
基本结构——激光光源
LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受激发射的辐射光放大。
激光光源的产生
受激吸收：处于较低能级的粒子在受到外界的激发（即与其他的粒子发生了有 能量交换的相互作用，如与光子发生非弹性碰撞），吸收了能量时，跃迁到与 此能量相对应的较高能级。
类型：正置，倒置 光路：
光源：汞灯、氙灯，观察分辨样品中产生荧光物质的成分与位 置。 源发滤光片：选择适合荧光物质激发波波长的范围 双色分光镜：初步分开激发和发射光组件、 阻滤片：获得更纯的发射荧光 物镜：激发和发射都由同一物镜实现。 目镜：10 × 用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马 达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。
确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择 应成熟的探针或标记方法。可通过查找文献和试剂公司产品目 录确定可以标记待测物的荧光探针的种类或范围。
考虑荧光探针的特性：荧光探针与样品的反应特性（与待测分 子或离子反应的选择性或专一性等），荧光探针的灵敏度和荧 光强度，荧光探针标记后样品的光谱特征（需要在仪器的检测 范围内），荧光的稳定性，样品中多重荧光的相互影响（避免 光谱交叉）。
免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。 外源性荧光物质进入组织内产生的荧光。某些药物 诱发荧光：生物胺类能与某些醛类物质在一定条件下缩合而发
生荧光。 酶致荧光：某些酶的反应能够发射荧光。
LSCM主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有 特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样 品待测物质具有荧光，然后再进行检测。
组织和细胞中的荧光来源
自发荧光：指组织细胞不经过任何荧光染色便能在短波长光的 激发下发射出的荧光，GFP就具有自发荧光，是标记靶蛋白的 特异性荧光探针。
荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发 出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成 和功能。有些可做活体染色。
自发辐射 ：粒子受到激发而进入的激发态，不是粒子的稳定状态，自发地从高 能级激发态（E2）向低能级（E1）跃迁，同时产生光辐射的过程。 众多原子以 自发辐射发出的光，不具有相位、偏振态、传播方向上的一致，是物理上所说 的非相干光。
受激辐射：除自发辐射外，处于高能级E2上的粒子还可以另一方式跃迁到较低 能级。当一个外来光子带来的能量正好对应能级差时（E2-E1），也会引发粒子 以一定的概率，迅速地从能级E2跃迁到能级E1，同时辐射一个与外来光子频率、 相位、偏振态以及传播方向都相同的光子的过程。