小鼠免疫

小鼠免疫

免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。

一、血清效价的影响因素

小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。

二、免疫材料

1．免疫用的动物

抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。

2．免疫原（抗原）

颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、•细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。

可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，•应先制备成人工免疫原，再加佐剂。

免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体

更合适。一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。

3．佐剂

目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。

种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。

弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。

三、免疫策略

1．免疫途径

途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。

脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。

一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。

2．免疫方案

典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。

第一次，弱抗体反应，主要是低亲和力的lgM抗体为主

第二次，产生增强的体液免疫，加强免疫产生的抗体中lgG数量明显增多。能刺激免疫应答的成熟，进一步扩增抗原反应性B细胞的数量，增加血

清抗体的效价。

6-10天，测效价。血清效价定义：在任何筛选试验中均能和抗原出现明显的、可检测到的反应的血清最大稀释度的倒数。至少＞1:1000。

通常，低血清效价的动物，得到克隆的概率低，并且通常是分泌lgM抗体，在这种情况下，可以改变抗原的形式，或者所以佐剂种类。若使用CFA/IFA佐剂不能产生有效免疫应答的抗原，在换用明矾作为佐剂后可能大大提高免疫原性。

血清有效价＞1:1000后，应休息3-6周，为了让增强的二次应答衰减，以便在最后一次接触抗原后导致新的B细胞的活化和扩增。

融合前的冲击免疫，抗原用生理盐水或者PBS稀释，不含佐剂。最有效途径是静脉注射，可以将抗原直接输送到脾脏，脾脏中新活化的B母细胞收获后可用于做融合。如果不适合静脉注射（颗粒状或者缓冲液有毒），可腹腔注射。静脉注射冲击3天，腹腔4天后融合。

四、免疫失败的原因及措施

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量；

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法；

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进；

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化；

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫间隔时间和次数，免疫的途径是否合适；

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。