全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微术名词解释
全内反射荧光显微术名词解释全内反射荧光显微术，听起来就像是从科幻电影里蹦出来的名词，是吧？其实它可是一种非常酷炫的显微镜技术，能让我们看到那些微小得像针尖一样的细胞和分子。
想象一下，把光线像小箭一样射向样品，当光线以一定的角度入射，嘿，光线就不再穿透，而是在界面上反射回来，这就是全内反射的魔法！这时候，样品里的荧光分子会被激发，发出闪闪的光芒，简直就像夜空中的繁星，令人心醉。
用这个技术，科学家们可以观察生物样品，像细胞膜、蛋白质等。
大家知道细胞是生命的基本单位，对吧？而这些微小的结构可不是轻易就能看清的，普通显微镜就像是用放大镜看远处的星星，模糊得很。
全内反射荧光显微术却像是把宇航员送到了太空，直接给你展示了细胞内部的每一个角落，真是让人眼前一亮。
这项技术的魅力在于，能在活细胞中进行观察。
别小看这一点，很多传统的显微镜技术可得把细胞弄得死去活来才能看清。
可是全内反射荧光显微术却让我们能够在“现场”观察，活生生的细胞在做什么，简直就像在看一场精彩的真人秀！你可以看到细胞的动态变化、分裂过程，甚至是它们如何和周围的环境互动，这些都是生命中最微妙的瞬间。
说到荧光，这里有个小秘密。
荧光分子就像是小小的发光棒，只有当它们被特定波长的光激发时，才会闪耀出美丽的光芒。
像小孩子玩耍一样，开心得不得了。
这种现象让我们能够区分不同的细胞，甚至标记特定的蛋白质，形成色彩斑斓的图像。
这些图像比任何油画都要生动，简直就是生命的艺术品。
想想看，科学家们在显微镜下能看到的那些细胞，像极了微缩版的城市，热闹非凡。
全内反射荧光显微术也让我们在医学研究中大放异彩。
比如在癌症研究中，科学家们通过观察癌细胞的特征，发现它们是如何突破正常细胞的防线，蔓延到其他地方的。
这种技术帮助我们了解疾病的根本，寻找更有效的治疗方案。
感觉像是在揭开一个个神秘的面纱，让我们看清楚那些潜藏在暗处的真相。
操作全内反射荧光显微术可不是随便拍拍的事。
它需要一套精密的设备和技术，像调整光路、选择激发波长，这些都得小心翼翼。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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全内反射荧光显微镜用途
全内反射荧光显微镜用途全内反射荧光显微镜，是一种高级显微镜技术，通过结合荧光技术和反射技术，使得观察样品更加清晰和准确。
该显微镜具有广泛的应用领域，特别是在细胞生物学、生物医学研究和材料科学等领域中发挥着重要作用。
全内反射荧光显微镜的主要用途之一是观察和研究细胞和组织的结构与功能。
通过标记荧光染料或荧光蛋白，可以使细胞内的特定结构或分子呈现出明亮的荧光信号。
这种显微镜技术可以用于观察细胞核、细胞器、细胞膜以及细胞内的信号传导通路等。
通过全内反射荧光显微镜的高分辨率成像能力，科研人员可以更加准确地研究细胞的形态、结构和功能，进一步揭示生物学过程的机制。
全内反射荧光显微镜还在生物医学研究中发挥着重要作用。
例如，在癌症研究中，科学家可以利用该显微镜观察和分析癌细胞的形态、活动和功能，进而研究癌症的发生机制和治疗策略。
此外，全内反射荧光显微镜还可以用于观察细菌、病毒等微生物的行为，帮助科学家研究它们的生长、传播和致病机制。
在材料科学领域，全内反射荧光显微镜也被广泛应用。
由于该显微镜具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以用于研究材料的表面和界面性质，例如薄膜的生长、表面化学反应以及材料中颗粒的分布情况等。
此外，该技术还可以用于研究材料的光学性质和电子性质等，为材料设计和制备提供重要的参考。
除了以上应用领域，全内反射荧光显微镜还可以在其他领域中发挥作用。
例如，在环境科学领域，可以利用该技术研究水体和土壤中微生物的分布和活动情况，进而了解生态系统的功能和稳定性。
在食品科学中，可以利用全内反射荧光显微镜观察食品中的微生物污染情况，保障食品的安全性。
在纳米技术领域，该技术可以用于研究纳米材料的光学、电子和磁性等性质，为纳米器件的设计和制备提供重要的信息。
全内反射荧光显微镜具有广泛的应用领域，在细胞生物学、生物医学研究和材料科学等领域中发挥着重要作用。
通过该技术，科研人员可以观察和研究细胞和组织的结构与功能，揭示生物学过程的机制；在生物医学研究中，可以帮助科学家研究疾病的发生机制和治疗策略；在材料科学中，可以用于研究材料的表面和界面性质，提供重要的参考。
全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
7
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
8
TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
3
传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
11
TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
14
物镜型TIRFM系统
tirf显微镜原理
tirf显微镜原理简介：TIRF（Total Internal Reflection Fluorescence，全内反射荧光显微镜）是一种用于研究界面和薄膜附近的生物发光过程的高分辨率显微镜技术。
本文将解析TIRF显微镜的原理，包括全内反射现象、波导耦合和荧光检测等方面，帮助读者深入了解这种重要的显微镜技术。
正文：1. 全内反射现象TIRF显微镜利用全内反射现象实现高分辨率成像。
当光束从高折射率的材料（例如玻璃）射入到低折射率的材料（例如溶液）时，当入射角大于临界角时，光束将完全反射，不进入低折射率材料。
2. 波导耦合TIRF显微镜利用光波在玻璃和样品之间发生全内反射来实现荧光成像。
一种常用的方法是通过特殊设计的金属或玻璃叫做波导，将激光束耦合到玻璃和样品的边界上。
波导保证了光束以全内反射的方式沿界面传播，通过控制波导与样品之间的接触面积，可以使激光束只在非常薄的区域内与样品相互作用，实现高分辨率荧光成像。
3. 荧光检测TIRF显微镜利用荧光探针标记的样品发出的荧光信号来进行观察。
在TIRF成像中，仅有与表面接触的荧光染料将被激发并发射荧光。
未被激发的荧光将不被收集，从而有效地减少了背景信号的干扰，提高了信噪比和成像的分辨率。
4. 超分辨率成像TIRF显微镜在满足一定条件下能够实现超分辨率成像。
通过控制入射角度、荧光染料的位置和波导耦合等参数，可以限制荧光激发区域的大小，使得成像分辨率超越传统荧光显微镜的衍射极限，实现更高的空间分辨率。
5. 应用TIRF显微镜广泛应用于生物科学的研究领域，特别是细胞和分子生物学。
通过观察细胞膜和介观尺度结构之间的相互作用、细胞内分子交互作用以及染料的分子动力学等，TIRF显微镜为研究生命科学中的各种现象和过程提供了高分辨率的实时成像手段。
总结：TIRF显微镜利用全内反射现象和波导耦合技术，实现了高分辨率的成像和荧光检测。
通过限制光激发区域和减少背景干扰，TIRF显微镜能够提供超过传统荧光显微镜的分辨率。
全内反射荧光成像基本原理
hv H**
H hv
S2
吸
放
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
精品课件
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
精品课件
全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
精品课件
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
精品课件
精品课件
隐失波强度成指数衰减曲线
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
精品课件
当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
TIRFM原理及应用
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
02.1 全反射
1. 2.
snell定律: n1sin θ 1=n2 sin θ 2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
02.2 隐失波
1.
如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33（生物细胞的折 射率范围是1.33-1.38），则玻璃／界面处的临界角为61.78°。从几 何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在剥离界面上完全反 射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能 量会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播。这部分光场就是所 谓的隐失波。
TIRFM在细胞生物物理研究中的应用
主讲人：秦继伟
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
01 TIRFM简介
全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反 射产生的隐失波激发样品,使样品表面数百纳米厚 的薄层内的荧光团受到激发，只有这个小范围内的 荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子 则完全不受影响。所以全内反射荧光显微术具有其 它成像方法无法比拟的高的信噪比，细胞的光损伤 和光漂白也很小。再用高灵敏度和高时间分辨率的 摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从 而实现对生物样品观测的一种技术。
正置荧光显微镜
倒置荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统的最大优点是在进行TIRFM实 验时可对样品进行其他操作，如改变样品介质、进行细胞显微注 射及微操作等。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
一、前言
全内反射荧光显微术（TIRF）是一种高分辨率、高灵敏度的显微技术，能够实现纳米级别的分辨率。
本文将从原理和应用两个方面详细介绍TIRF技术。
二、原理
1. 全内反射
全内反射是一种光学现象，当光线从密度较大的介质（如玻璃）射向
密度较小的介质（如空气）时，若入射角大于一个临界角，则光线会
被完全反射回去，不再穿透到空气中。
这个临界角叫做全内反射角。
2. TIRF显微镜
TIRF显微镜是基于全内反射原理设计的一种显微镜。
它利用高数值孔
径物镜和倾斜入射光束使样品表面与载玻片之间形成一个极浅的折射
率差异层，使得只有非常靠近载玻片表面的样品区域被激发并发出荧
光信号。
TIRF显微镜可以获得非常高的信噪比和空间分辨率。
3. 激发光的入射角度
TIRF显微镜的关键是控制激发光的入射角度，使其大于全内反射角，
从而只有极浅的样品区域被激发。
这可以通过改变入射光的方向或倾
斜载玻片来实现。
4. 应用
TIRF显微镜广泛应用于细胞和分子生物学研究中，例如：
（1）观察细胞膜表面分子，如受体、通道和酶等。
（2）研究单个蛋白质分子在细胞膜上的动态行为。
（3）研究细胞内钙离子信号传递过程。
（4）研究蛋白质聚合和聚集现象等。
三、总结
TIRF显微镜是一种高灵敏度、高分辨率的显微技术，利用全内反射原理实现了非常浅层次的样品激发。
它在生物学、医学和材料科学等领域得到了广泛应用。
全内反射荧光显微镜剖析
隐失波
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻 璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于 波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中， 是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而 振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。
2.3全内反射荧光显微镜特点
①信噪比高（相对共聚焦显微镜） ②分辨率高（相对其他的光学显微镜） ③对生物样本损伤小，可以进行活体物质的研究
和单分子的动态研究。 ④全内反射的荧光激发深度只在～100 nm 的薄
层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化 学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成 像技术。 ⑤全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像, 大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求。
5. 在生物单分子研究中的应用
细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信 号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞 表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表 面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深 层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来 说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧 光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激 发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成 为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单 分子动力学的最有前途的光学成像技术。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
初级感觉神经元的分泌和胞吞：单个囊泡行为的全内反射显微成像(TIRFM)研究
初级感觉神经元的分泌和胞吞：单个囊泡行为的全内反射显微成像（TIRFM）研究位于背根神经节（DRG）的初级感觉神经元表达多种神经肽，这些神经肽从神经元的末梢和胞体等区域的致密囊泡（DCV）分泌出来，起到调节神经元突触传递，细胞兴奋性和调控基因表达等重要作用。
分泌过程是神经肽行使其功能的重要调节步骤，然而以往对于这一过程的研究主要在神经内分泌细胞上进行，对神经元神经肽分泌多采用生化方法检测，不足以阐明这一精细调控的过程。
因此我们采用实时成像的方法对DRG神经元神经肽分泌的调控进行了研究。
在此过程中，我们还意外地发现了一个内吞的负向调控因子，于是我们进一步对其作用机制进行了研究。
本论文将分别对这两部分工作进行介绍。
第一部分研究DRG神经元神经肽分泌的调控。
我们首次将全内反射荧光显微镜（TIRFM）成像应用于DRG神经元，用NPY‐pHluorin作为分子标记，在单个囊泡水平观察刺激引起的神经肽分泌。
TIRFM 记录到的单囊泡分泌事件有NPY‐pHluorin“完全释放型”和“不完全释放型”两种，提示DRG神经元中神经肽的分泌受到融合小孔（fusion pore）的调节。
对胞体和轴突的同时记录发现，除了我们已知的胞体分泌，DRG神经元的轴突各部分也存在刺激依赖的DCV分泌，两者对于刺激的响应均表现出较长的延迟。
去极化及电刺激引起的轴突囊泡分泌的数量显著多于胞体，分泌时程也显著快于胞体，尽管轴突的内钙浓度并不比胞体更高，说明DCV在不同细胞区域的分泌位点受到严格的调控。
然而激活DRG神经元上的温度敏感通道TRPV1引起的神经肽分泌在轴突和胞体间没有明显的差异，其单个事件的动力学与去极化引起的分泌有显著的不同，有更多的不完全释放型的事件发生。
这一发现表明不同的生理刺激可以对分泌的位点和融合小孔进行调节，进而调节递质的分泌。
第二部分研究DRG神经元内吞的调控机制。
内吞过程的精确和有效的调控对于突触传递，细胞膜平衡，细胞膜表面的通道和受体的平衡等都具有重要的作用。
全内反射荧光显微镜_单分子荧光能量共转移_
全内反射荧光显微镜单分子荧光能量共转移1. 引言1.1 概述本文旨在介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术，并探讨它们在生物医学领域的应用。
全内反射荧光显微镜是一种基于全内反射现象的高分辨率显微镜，可以实现非常高的空间分辨率和极低的背景噪音，因此被广泛应用于生物体系中超分辨率成像的研究。
而单分子荧光能量共转移是一种用来研究生物体系中分子之间相互作用和结构动态变化的方法，在生命科学领域具有重要意义。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分：引言、全内反射荧光显微镜、单分子荧光能量共转移、实验结果与讨论以及结论。
在引言部分，我们将对本篇文章进行简要介绍，并概述全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的背景和意义。
随后，在接下来的几个部分，我们将逐步深入探讨这两项技术的原理、发展历程、应用领域以及实验方法与技术要点。
最后，我们将介绍相关的实验结果，并进行结果讨论与解释。
在结论部分，我们将对本文进行总结回顾，并探讨存在的问题及未来展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的原理和应用，并通过实验结果与讨论来验证这两项技术在生物医学领域中的有效性。
通过本文的阐述，读者可以了解到这些重要技术在研究生物体系中起到的关键作用，并对未来发展方向有所启示。
2. 全内反射荧光显微镜部分的内容如下：2.1 原理介绍全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的高分辨率荧光显微技术。
其原理是利用高折射率物质与低折射率域之间的全内反射现象，将激发光只聚焦在非常薄的表面层上，进而使得观察对象处于极低背景的强照射区域。
相比传统荧光显微镜，TIRFM 具有更高的信噪比和更好的空间分辨率。
在TIRFM中，通过特定角度入射到玻璃-样品界面上的激发光会被全内反射。
当样品中存在荧光探针时，这些探针会受到入射激发光的刺激并发生荧光发射。
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜（TIRFM）系统全内反射荧光显微镜TIRFM系统介绍一、全内反射荧光显微镜的原理及其在生物领域的应用全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope TIRFM)利用光从高折射率的介质进入较低折射率的介质时，如果入射角足够大时则光全部被反射而不发生折射，但是在两种介质的界面会产生衰逝波可以激发近界面100nm范围内的荧光的原理来实现对物体表面的观察。
可通过常规荧光显微镜的照明器或特殊照明器送入激发光，并对激光的入射角度进行控制，采用瞬间场激发方法以避免激发光进入探测器，在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的。
为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。
这可以通过棱镜(prism)实现，称为prism-based TIRFM，也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为objective-type TIRFM。
现在商品化的全内反射荧光显微镜一般都是物镜类型的，速度快，精度高。
Wide field FL TIRFM全内反射荧光显微镜由于能实现物体表面非常薄范围内（小于100nm）荧光观察，故在某些生物领域得到广泛应用。
如以下等应用：1、细胞表面图象的观察。
如细胞膜表面结构，细胞表层的接触，膜表面动力学/蛋白质定位Fixed 3T3 纤维原细胞细胞免疫化学标记微管蛋白2、单分子观察及其操作。
肌球蛋白，肌动蛋白与Cy3标记ATP3、细胞膜表面运动。
如泡吞、泡吐现象，泡外分泌现象。
表达GFP-肌动蛋白的培养MAST 细胞正在胞饮4、细胞膜钙火花现象的观察，离子通道监视G蛋白偶联钙离子通道监视5、分子马达研究旋转的马达、细胞骨架蛋白、聚合体、G蛋白、环状蛋白、核苷酸马达RNA聚合酶反应除了在生物领域外，在化学领域等对于化学分子结构观察中也有很好的应用。
二、全内反射荧光显微镜的基本组成全内反射荧光显微镜主要由四部分组成。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍介绍
n光束容易校准 n数值孔径越大，分辨率越高 n数值孔径大，有更多的激发光强 可以用来产生全反射 n全内反射角度调节范围更大
100x NA1.4
100x NA1.65
0.04mm
0.21mm
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DiI染色的Hela细胞
TIRFM FLM
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全内反射荧光显微镜的基本组成
•高级研究级显微镜
一般为倒置显微镜，配荧光照明器、高数值孔径的物镜
•TIRFM照明器
通过光纤接入激光，并对激光入射方向进行控制，通过L型照明器实现 和荧光照明器一起从荧光通道进入显微镜
•激光器
根据实验要求选择，可以接入单激光器或者多激光系统
•检测系统
应选择高灵敏度制冷CCD，要求CCD量子效能高，能够对极弱荧光进行 捕捉，具有上千倍的信号放大功能，如果是对快速荧光信号进行捕捉则 还需要高速CCD
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
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目前使用CCD 探测, 可达到的量子产率 已到～80 % ,成像 速率～200 Hz.
全内反射显微镜的分型及其结构
全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型
两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。
（一）棱镜型全内反射荧光显微镜
利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。
TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如 细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。
生物单分子荧光检测技术的比较
共聚焦激光扫描显微 （CLSM） 双光子激光扫描显微 镜（TPLSM） TPLSM对生物系统和 体内细胞性质具有高 的分辨率。双光子激 发能探索活细胞内各 种分子的实时动态， 能实现在样品中的高 度精确定位。减少了 光损伤，特别对需要 条件温和的生物体系 有利 全内反射荧光显微 镜（TIRFM） TIRFM具有高度的 界面（表面）特异 性，可有效排除本 体干扰，获取界面 信息。纵向分辨力 极高，特别适用于 表面或界面单分子 的测定。全内反射 荧光法相对简单， 费用低廉。表面 或界面单分子的测 定
全内反射荧光显微术的发展历程
近年来人们开发出了一系列光学显微镜。 其中，全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)是 近年来新兴的一种光学成像技术。
肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生， 荧光标记驱动蛋白动态研究。
4.吸附
• 用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分
子吸附行为 。
全内反射荧光显微镜下拍到 的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图
分别在全内反射荧光显微镜下（左）和 一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,细 胞。
• 全内反射荧光显微镜（TIRFM）是研究紧贴固体
全内反射荧光显微镜
医学实验05级
张园 郑雪飞 宋一萌 解依荻
发展与展望
优势应用
分型及结构
基本原理
发展历史
发展历史
荧光显微镜的概念 全内反射荧光显微术的发展历程
发展历史
荧光显微镜的概念
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。
二者比较
棱镜型全内反 射荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜
05级医学实验 宋一萌 90513111
• 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生
的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。 • 当今世界上研究单分子科学最具前途的新 型生物光学显微技术之一 • 可用来实现对单个荧光分子的直接探测。
90年代 20 新型物镜透镜、聚光 世 镜和超灵敏探测器的 纪 出现，使TRIFM技术
得到充分发展。
Axelrod等生物物理 20 学家对TRIFM技术 世 及基本原理进行描 纪 述，并探索了其生 物应用。
80年代早期
1965年
Hirsch field
完成了 第一个 全内反射 荧光实验
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
隐失波的强度-深度图
荧光激发原理
T12（θi）- 分界面处的透射强度 θi - 入射角 d 12 - 渗透深度 λ - 入射光波长
透射强度和浸透深度公式
对于可见光波长 380 ～ 780nm而言， 浸透深度为～ 100nm。
箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。 黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点表示未被激发的荧光分子。
解依荻
全内反射应用的核心问题
全内反射应用的核心问题是
制作与电子显微术（EM）切 片尺寸相当的光学切片。
共焦技术 VS.全内反射技术
共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深 度分别为～500－800nm。 全内反射显微术: 典型的垂直照明深度 <100nm。 结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。
• 全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优
势(它的荧光激发深度只在～100 nm 的薄 层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生 物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。
• 全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成
像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像 的要求;另一方面它的图像解释相对于近场, 干涉显微成像来说也较简单。
这些问题都可以利用全内反射荧光显微成 像系统来解决
全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的 过程进行观测，而不受到来自细胞内深层 区域信号的干扰。
全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学 如生物化学动力学、单分子动力学的最有 前途的光学成像技术
利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。
• 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态
构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光 显微术。 • 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白， 然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光 基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象， 说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。
2.蛋白分子相互作用
• 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反
射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接 观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 • 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(cochaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相 互作用已经在单分子水平进行了很好的研 究。 • 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平 生物大分子相互作用的成像。
• 现在全内反射荧光显微术已被广泛用于
• • • • •
实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动
• 全内反射荧光显微术的发展一方面会
在加强传统优势的基础上，即动态观 察生物大分子的结构、相互作用、物 质的分泌，同时在不断的改进物镜和 CCD相机的性能基础上进一步同其他 仪器的结合，更多的用在生物细胞活 体方面的研究。
棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
评价
棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。
在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。
放置样品的空间受到棱镜的限制。
（二）物镜型全内反射显微镜
收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜
发生全内反射的光学器件。
由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 , 因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为： NA = nsin（u/2） nsin（u/2） > nsinθc NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的 折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全 反射的临界角。
1. 全内反射荧光显微术 在生物单分子科学中的应用
• 单分子荧光探测主要有三个问题： • （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱
的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。 • （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光 等产生的背景光，极大的干扰了信号光的 探测。所以应该尽量降低背景激发光。 • （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景 光。
全内反射的应用比较
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和双光子激光扫描显 微镜（TPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。 CLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集 光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦） 可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它 地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大 约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄 层的厚度（200nm）。
荧光激发原理
snell定律:
n1sin θ1=n2 sin θ2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
荧光激发原理
非均匀波
沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数衰减。
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像。
1996年
Moerner小组 又用这项技术 实现了限制在 这是首次尝试用全内反射荧光 丙烯酰胺胶体 法测液体中的单个分子的荧光。 的纳米孔中的 将全反射理论与生物细胞的荧 单分子的三维 光成像技术相结合是一种全新 成像。 的突破。
平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固 体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数 性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对 结果的解释具有一定的困难性。 因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技 术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。
•
The application of the total internal reflection fluorescence microscopy
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM）
全内反射的应用比较
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全 反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分 子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围 通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性， 只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大 大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛 应用于细胞表面物质的动态观察。