动物传染病防控技术与科研需求-陈焕春

Attenuation fa 1
100
-
APP ApxⅡC-基因缺失株对猪的免疫保
护
Groups
Serovar of challenge
Mortality
Survival rate
Protectiv rate (%)
Serovar 7
0/4
Apx IIC-
Serovar 1
3/4
4/4
100
3/4
pCI-52 pCI-52M
❖ 在ORF5基因N端胞外区的 诱骗表位与中和表位间插入 辅助序列，使中和表位充分 展示，可显著增强免疫原性
Titer
16
12
8
4
0
2 weeks
4 weeks
6 weeks
Time after primary immunization
。
中和抗体
3
2.5
2
SI
5’---FAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELN---3’ 1.5
二、动物传染病防控科研需求 ——基础研究
病原学研究 病原与宿主相互作用研究 动物基础免疫学研究 临床诊断及检测检验技术研究 药物靶标和兽药作用机制研究 动物源性食品安全研究
1. 开展更加系统的病原学研究
新病原分离鉴定、病原生态学与流行病学的研 究：为动物重大疫病的防控提供理论依据
❖其作用机制在于：伪狂犬病毒编码的gG是一种分泌 性的、并且能与机体内游离的趋化因子结合的特殊蛋 白。gG的缺失可使机体内游离的趋化因子更容易识 别病毒，快速诱导免疫应答。
PRV激活天然免疫反应
通过荧光素酶报告系统分析并发现PRV激 活IFN-β启动子。
Relative luciferase activity
5
0
6h
12h
24h
800000 600000 400000 200000
0
706087
970278
1499264 1533475 1259308
1127571
2003年 2004年 2005年 2006年 2007年 2008年
3.拒外来病于国门之外对兽医学科的需求
非洲猪瘟 疯牛病 裂谷热 西尼罗脑炎 尼帕病毒病 埃博拉病
编码RNA 揭示宿主对某些病原的免疫识别与免疫应答以及病原体的
免疫逃避与免疫抑制的分子机制 为疫病诊断、疫苗研制与抗病育种奠定基础。
4. 兽医临床诊断及检测检验技术
疾病过程中的一些特异表达的因子和特异调节因 子及其蛋白组学或酶组学的分子检测和监控技术 的研究，对于疾病的准确诊断和预后监控评估具 有重要价值。
④ 新型疫苗载体的开发 ——提高安全性
发展生物安全性好、载体反应小、抗原递 呈能力强、操作简便、增殖滴度高的新型 疫苗载体是基因工程疫苗研究的重要方向。
新型杆状病毒载体 复制子载体
⑤ 病毒样颗粒疫苗——新的疫苗革命
病毒样颗粒不存在病毒核酸，因而不具有 感染性，但却具有和天然病毒颗粒一样的 免疫原性。免疫效果有的甚至优于传统的 弱毒疫苗
Strain tested 亲本株
(serotype 7)
基因缺失株
对照组
Bacterial concentration (CFU) a 2×108 1×108 2×107 2×109 1×109 2×108
TSB broth
No.dead/No.tested
10/10 10/10 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10
动物传染病防控技术与科研需求
陈焕春 华中农业大学
一、兽医学的战略地位
兽医学是保障动物和人类健康的重要学科，在动 物疾病、人畜共患病、食品安全、公共卫生和生 态环境健康等方面起到主导性作用。随着“一个 世界、一个医学、一个健康”和“健康动物－健 康食品－健康人类”新观念的提出，兽医学的作 用正在不断的扩大和延伸，在国民经济和社会稳 定中发挥着越来越重要的作用。
75
Serovar 7
4/4
0/4
0
Control
Serovar 1
Hale Waihona Puke Baidu
4/4
0/4
0
❖基因缺失疫苗株对同源血清型野生菌的攻击获得 了完全保护，对异型野生菌攻击的免疫保护率达 到75％。
③ 病毒/细菌活载体疫苗 ——一针防多病
猪伪狂犬病毒和禽痘病毒分别作为猪用和 禽用的活病毒载体，得到了广泛开展并取 得了显著的成果。
30
25
mock
20
UV
15
virus
10
5
0
6h
12h
24h
Relative luciferase activity
14 12 10 8 6 4 2 0
6h
IRF3
mock UV virus
12h
24h
Relative luciferase activity j
NF-κB
45 40 35
30 25 20 15 10
物疫苗免疫预防之道
TK-/gG-基因缺失疫苗独特的效果
➢ 可用于新生仔猪的超前免疫，安全性高 ➢ 可用于紧急预防注射，16-24h左右产
生极显著的治疗效果 ➢ 产生的抗体水平高、作用时间快、安全
性高、免疫效果好等方面都超过国外的 同类产品。 ➢ 通过在全国上亿头份的临床应用充分证 实了这一效果的确实性和可靠性
2019 SARS
2019
高致病性 禽流感
2019
人—猪链 球菌病
2019 乙型脑炎
2009
甲型H1N1 流感
35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000
0
2003年
2004年
2005年
2006年
2007年
2008年
戊肝 狂犬病 乙型脑炎 布病
1800000 1600000 1400000 1200000 1000000
↑
Ｎ34
↑
Ｎ44
↑
Ｎ51
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
0 PCI-neo PCI-52 PCI-M34 PCI-M51 PCIM34+51 首免４周 首免６周
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0 PCI-neo
PCI-52
PCI-M34 PCI-M51
PCIM34+51
② 基因缺失标志疫苗 ——未来疫苗发展的重点
2.加强人兽共患病的防控、保障人民 生命财产安全，对兽医学科的需求
60％的人类传染病来源于动物，50％的动物传染 病可以传染给人。当今人类新发传染病80％来源 于动物。
在1400多种引起人类疾病的病原中，有800余种是 通过了种间屏障是由动物病原引起。在过去25年， 出现38种新病原体，其中75％源于动物。
高致病性禽流感病毒H5N1病毒样颗粒基因 工程疫苗已经进入III期临床
四、动物传染病综合防控技术
1. 动物传染病诊断技术 病原学诊断技术：
病原的分离鉴定 PCR、ELISA、IFA（间接免疫荧光）
血清学诊断技术：用于抗体的检测 快速诊断技术：
胶体金试纸条 乳胶凝集试验 ELISA
以伪狂犬病毒为载体的基因工程疫苗研究
伪狂犬－口蹄疫（Vaccine，2019） 伪狂犬－猪乙型脑炎（Vaccine，2019） 伪狂犬－猪圆环病毒（Vet Microbiol，2019/2019） 伪狂犬－蓝耳病（vaccine，2019） 伪狂犬－猪细小病毒 伪狂犬－流感 伪狂犬－猪瘟 伪狂犬－蓝耳病－猪圆环病毒
鉴别诊断技术：
区分免疫动物和野毒感染动物 多病原混合感染鉴别诊断
禽流感病毒乳胶凝集检测试剂盒
禽流感病毒胶体金试纸条
敏感性
样 品 本试纸条
韩国
1：2
++++
++
1：4
++++
++
1：8
++++
+
1：16 ++++
+
1：32
+++
-
1：64
+++
-
1：128
++
-
1：256
+
-
1：512
+
-
1：1024
表位A（诱骗表位） 表位B（中和表位）
1
0.5
辅助序列
0
pCI-neo
pCI-52
pCI-52M
细胞免疫
消除ORF5基因潜在的N-糖基化位点能进一步提 高免疫原性
OD630
Stimulated Index(SI)
表位Ａ
表位 B
5 ’…….CFAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTD…..３’
开展兽医临床诊疗技术、兽医检测检验技术和现 代分子诊断技术及其在动物疾病诊断、食品安全 和公共卫生等方面应用的研究
5. 药物靶标和兽药作用机制研究
兽药是养殖业赖以生存 和发展不可缺的物质
基于基因组学、蛋白组 学的高通量信号通路分 析，高通量筛选药物作 用新靶标，先导化合物 的制备、结构修饰与优 化，药物生物标志物的 发现。
1.畜牧业的快速发展对兽医学科的需求
我国是畜牧业大国，但畜牧业经济效益远未达到世界平均水 平，主要原因是动物疾病问题。
动物疾病引起动物死亡造成的直接经济损失每年达400亿元以 上，引起饲料、药物、人工浪费等间接经济损失上千亿元。
动物疫病的日趋复杂。主要表现为老的疾病不但没有被消灭， 反而呈重新抬头的趋势，如口蹄疫、新城疫、猪瘟和小反刍 兽疫等，同时新病又不断出现，如禽流感、高致病性蓝耳病、 猪圆环病毒等。多种疾病的混合感染现象严重，细菌性疾病 危害越来越大，给防治造成了困难，经济损失巨大
病原基因组学研究：揭示病原遗传变异规律和 重组产生新病原的潜能
转录组学、蛋白质组学、代谢组学和免疫组学 研究：为揭示动物病原的生长、代谢、调控、 致病与免疫机理等奠定基础
病原大分子结构与构像的解析及基因网络与调 控研究：从分子水平揭示致病机理。
2. 深入研究病原与宿主的相互作用机制
与吸附、黏附、侵袭相关的病原组分及其受体 的发现
使区分免疫动物和野毒感染动物成为可能，为疫 病的根除提供强有力的技术支撑。
猪伪狂犬病基因缺失标记疫苗及其配套鉴别诊断 试剂的联合应用是成功控制和根除动物疫病的典 范。美国等一些国家成功地根除了猪伪狂犬病。
同时其它病毒，如猪瘟、新城疫、牛传染性鼻气 管炎病毒等病毒的基因缺失标记疫苗在最近几年 得以广泛开展，从而为实施这些传染病的根除计 划奠定了基础。
三、动物传染病防控科研需求 ——高技术研究
① 疫苗的分子设计越来越受到重视
在病原基因组学、蛋白质组学、反向疫苗学 和结构生物学等技术的推动下，挖掘具有良 好免疫原性的基因工程疫苗靶抗原、对已有 的靶抗原进行修饰改造以进一步提高其免疫 原性
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因修饰增强免疫
原性
24
20
猪传染性胸膜肺炎基因缺失疫苗
❖以猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清7型为出发菌株，构建了 毒素II(ApxII)激活基因C基因缺失而又不影响毒素II结构基 因A基因的基因缺失疫苗株(APP ApxIIC-)。
Western blot 1:parent strain； 2:mutant strain
基因缺失株APP ApxIIC-与亲本菌株相比毒力已 显著降低，具有很高的安全性
-
-
阴 性 对 照
阳 性 对 照
阳性样品
阴性样品
ELISA诊断方法配 合自动化工作站， 可进行疾病的大规 模流行病学调查
2. 动物疫病预防控制策略
少打针、少用药、环境友好 注重特异性和非特异性免疫的双重作用，
激发机体的天然免疫反应 研制多价基因工程疫苗，减少免疫次数 对于细菌性疾病要减少抗生素使用，走生
表达猪瘟病毒E2的重组伪狂犬病毒二价疫苗能 同时抵抗两种病毒的攻击
以禽痘病毒为载体，表达新城疫病毒和H5亚型 禽流感病毒免疫原性蛋白的重组活载体疫苗已 在美国获得生产许可证
比较成熟的疫苗载体：
猪伪狂犬病毒载体 痘病毒载体 新城疫病毒载体 沙门氏菌载体
正在开发的活病毒/细菌载体：
猪瘟病毒载体 猪胸膜肺炎放线杆菌载体
6. 重视动物源性食品安全研究
食品安全是全世界共同关注的热点问题
对药物残留、违禁物品的检测与监控 对沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等重要食源
性微生物的分离鉴定、快速检测以及消除污染 的策略研究 食源性寄生虫病与人兽共患病病原学、预防、 控制技术及其基础研究
为提高动物源性食品安全，保障人民健康 提供技术支撑。
病原及其组分侵入宿主细胞和在胞内运输的分 子细节的解析
感染宿主的基因表达差异、信号转导途径和调 控网络的揭示
为病原体的组织嗜性、跨种感染、致病的 分子机制阐明及药物靶标发现与药物分子 设计提供理论依据。
3. 加强动物基础免疫学研究
病原的保护性抗原、B细胞表位和T细胞表位的筛选 多种动物免疫相关的信号分子、效应分子、调控分子和非
IFN β 50
40
30
20
10
0 mock
PRV wt
➢ 进一步的分析发现PRV在感 染细胞后对IFN-β的激活随 着时间的延长而递增，24h 达到高峰。
➢ PRV激活IFN-β不依赖于 IRF3，其作用机制十分独特。
Relative luciferase activity
IFN β
45
40
35