第三章 生产菌种的培养与保藏

第三章生产菌种的培养与保藏菌种的扩大培养：即种子制备，是发酵生产的第一道工序。

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的菌种的过程。

目的：提供发酵产量高、生产性能稳定、数量充足、未被杂菌污染的生产用菌种优良种子应具备的条件1、菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。

2、菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求3、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求4、无杂菌污染，保证纯种发酵5、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力第一节种子制备的过程两个过程：孢子制备过程－固体培养基上培养孢子，种子制备过程－液体培养基上培养菌丝。

一、孢子制备（一）放线菌孢子的制备1.一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、无机盐2.C和N源不要太丰富（C约为1%，N约为0.5%）3.干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。

4.斜面培养温度大多为28℃，少数为37℃。

5.培养时间5~14天。

（二）霉菌孢子的制备1.霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。

2.霉菌培养温度大多为25~28℃。

3.培养时间4~14天。

（三）细菌孢子的制备1.一般采用琼脂斜面培养基，碳源限量而氮源丰富，如牛肉膏、蛋白胨作有机氮源2.细菌培养温度大多为37 ℃少数为28 ℃。

3.细菌和菌体培养时间1~2天，可产芽孢的菌则5~10天二、种子制备是将固体培养基上培养出来的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。

目的：形成一定数量和质量的菌体。

方法：摇瓶种子制备和种子罐种子制备摇瓶种子制备：某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐。

培养基要求比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。

种子罐种子制备：一级种子、二级种子……N＋1级发酵种子罐的级数主要决定于菌种的性质、菌体生长速度、发酵设备的合理应用。

✓细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。

茄子瓶→种子罐→发酵罐✓霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐✓放线菌：生长更慢，采用四级发酵确定种子级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。

但也与所选用工艺条件有关。

如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。

第二节种子质量控制一、影响孢子质量的因素及其控制(一)培养基影响因素：原材料；琼脂的牌号不同；水质的影响注意事项：原材料需经过化学分析及摇瓶发酵实验严格控制灭菌后的培养基质量使用前应在适当温度下放置一定时间考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择(二)培养温度和湿度菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的，培养温度不同，菌体的生理状态也不同。

因此，需要用最适合孢子生长的温度进行培养。

龟裂链霉菌斜面最适温度为36.5 ～37℃培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。

在北方相对湿度控制在40%～45%；而在南方则控制在35% ～42%(三)培养时间和冷藏时间1、孢子的培养时间孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。

2、孢子的冷藏时间冷藏时间宜短不宜长。

冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右冷藏，发现冷藏7~8天菌体开始自溶。

而培养5天后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。

例如在链霉素生产中，斜面孢子在6˚C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

(四) 接种量制备孢子时的接种量要适中。

接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状况。

二、影响种子质量的因素及其控制(一) 培养基主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。

选用原则：营养成分适合种子培养的需要；营养成分要尽可能地和发酵培养基接近；pH值要比较稳定(二) 培养条件（1）温度（2）通气量: 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。

例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。

但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。

(三) 种龄种龄：种子罐中培养液从开始接种到移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间。

最适的种龄为生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。

种龄过短—→前期生长缓慢、整个发酵周期延长。

种龄过长—→生产能力下降、菌丝过早自溶(四) 接种量接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。

采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。

生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。

双种法：二只种子罐接一只发酵罐倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐作种子三、种子质量标准细胞或菌体：以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态；以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。

生化指标：种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化。

产物生成量：测定产物含量。

酶活力：如胞内的淀粉酶等。

四、种子的异常状况菌种生长发育异常：与孢子质量和种子罐的培养条件有关。

菌丝结团：与搅拌效果差、接种量小有关。

菌丝粘壁：在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。

第三节种子保藏与复壮一、菌种保藏优良菌种被选育出来后，要保持其生产性能和稳定、不污染杂菌、不死亡，这是保藏菌种的主要目的。

（一）菌种保藏的原理根据菌种的生理生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

通常利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），采用的方法有低温、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质，以降低菌种的代谢活动，减少菌种的变异，达到长期保存的目的。

（二）菌种保藏的方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。

一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

1、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。

应用范围：适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。

优点：简便易行，容易推广，存活率高缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2、液体石蜡封藏法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝。

应用范围：适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好。

优点：操作简单，保藏时间长（1 ～2年）缺点：对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。

3、固体曲保藏法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体（孢子）后，在室温或低温加以保存。

应用范围：适用于产孢子的真菌要点：控制适当的水分4、沙土管保藏法先将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。

50℃烘干并经无菌检查后备用。

需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，封口后置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。

特点：保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。

它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。

5、冷冻干燥法用保护剂（脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等）制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

应用范围：适用于除不产孢子的丝状真菌之外的其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等优点：保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低缺点：该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需冻干机6、液氮超低温保藏法是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。

其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。

应用范围：适用于各种微生物菌种的保藏优点：操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上；可使用各种培养形式的微生物进行保藏（孢子或菌体、液体或固体）缺点：超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高（三）菌种保藏的注意事项1、菌种在保藏前所处的状态绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体。

2、菌种保藏所用的基质斜面低温保藏：碳源应少些、营养成分应贫乏砂土管保藏：砂和土要充分洗净冷冻干燥：应注意保护剂3、操作过程对细胞结构的损害二、菌种的复壮菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。

菌种衰退：生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，逐渐向不利于生产的方向发展变化，这种变化称之为菌种衰退。

1. 纯种分离法通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。

采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。

2.淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。

3.选择合适的培养条件将保藏后的菌种接种在保藏前所使用的同一培养基上，有利于原有性状的恢复。

概念和思考题种子制备菌丝粘壁孢子进罐法菌种衰退一级种子复壮二级种子二级发酵种龄接种量菌丝结团1.影响孢子质量的因素及其控制2.影响种子的质量及其控制3.种子异常的分析4.菌种保藏的原理及常用保藏方法5.衰退菌种复壮的措施。