免疫沉淀试验
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
临床医学检验临床免疫技术：沉淀反应测试题(题库版)
临床医学检验临床免疫技术：沉淀反应测试题（题库版）1、单选在琼脂板上打两排孔，左侧孔加入待测抗原，右侧孔加入已知抗体,抗原在阴极，抗体在阳极。
通电后，抗原泳向阳极，抗体流向阴极，观察在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
本试（江南博哥）验采用的是OA.免疫电泳B.免疫固定电泳C.蛋白电泳D.火箭电泳E.对流免疫电泳正确答案：E参考解析：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速免疫扩散技术。
2、单选不是免疫比浊试验中伪浊度形成的原因（）A.高血脂标本B.标本反复冻融C高效价抗体（＞1：200）D低效价抗体（＜1：20）E.试剂污染正确答案：C3、单选沉淀反应的钩状效应现象指的是OA.抗原过量B.抗体过量C.沉淀物显著D.凝集明显E.抗原和抗体的比例正确答案：A4、单选对流免疫电泳中，抗体向阴极移动原因是OA.抗体带正电B.抗体带负电C.电渗作用D.电泳作用E.抗原带正电正确答案：C参考解析：对流免疫电泳的原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原流向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
5、单选下列有关沉淀反应第二阶段的说法，错误的是OA.形成可见的免疫复合物B.出现肉眼可见的沉淀线或沉淀环C.可用散射比浊测定反直结果D.几秒钟至几分钟内即完成E.可用透射比浊测定反应结果正确答案：D6、单选环状沉淀试验中要求OA.抗原澄清B.抗体澄清C.抗原和抗体都必须澄清D.对抗原和抗体没有特别要求E.抗原比重大于抗血清正确答案：C参考解析：环状沉淀试验：在一定内径(1.5→.Omm)的玻璃管中先加入抗血清，再沿管壁加入抗原溶液，因抗血清比重大于抗原，故在两者交界处形成清晰界面，此处抗原抗体生成物在一定时间内形成白色环为阳性。
要求：抗原抗体溶液澄清。
适用于微量抗原测定。
考点：环状沉淀试验7、单选下列关于光学检测原理的叙述何者正确OA.荧光检测时，激发光与发射光处于同一直线上B.反射比色检测时，入射光与反射光处于同一直线上C.透射比浊检测时，入射光与透射光处于同一直线上D.散射比浊检测时，入射光与散射光处于同一直线上E.磷光计检测时，入射光与发射光处于同一直线上正确答案：C参考解析：透射比浊法的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量，当光线通过时，由于溶液中存在的抗原抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。
沉淀反应
二、 絮状沉淀试验
絮状沉淀试验：是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉 眼可见的絮状沉淀物。 方法评价：敏感度较低、简便、受抗原抗体 比例的影响非常明显 应用：性病研究实验室试验（VDRL）、USR、 RPR，本实验只能作为定性或半定量实验方法。
絮 Ag
1:2
状
沉淀线靠近谁浓度则小，沉淀弧趋向谁分子量则大
1表示待检Ag 2表示标准Ag 两条沉淀线互相吻合相连，表明两个抗 原完全相同。 两条沉淀线呈部分相切，表明两个抗
原之间有部分相同。
两条沉淀线交叉而过，表明两个抗原 完全不同。 待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较 低；
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。
＋
－
对流免疫电泳
• 优点及应用 • 电场限制了抗原抗体运动方向，加速了 反应速度，使反应时间大大缩短了，灵 敏度显著提高了，本法主要用于一些病 原微生物及其他蛋白质抗原的检测。
二、火箭免疫电泳
rocket immnoelectrophoresis，RIE
1、原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原 向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动 的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的 沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性 复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗 原量呈正相关。
体量固定，所测吸光度与复合物的量成正比，与
待测抗原量成正比。用已知浓度的抗原标准品建 立标准曲线，根据待测样品的吸光度可得出抗原
的含量。
2、方法：
1) 稀释检测标本和标准抗原（5个浓度） 2) 将稀释标本和标准抗原与适当过量的抗血清混 合反应 3) 在340nm处测各管吸光度（IC：35~100nm，选择 范围：290~410nm）
免疫沉淀类试验——免疫比浊
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
可溶性抗原与相应抗体在适 当条件下发生特异性结合所出现 的沉淀现象。
分类
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
反 应
单向免疫扩散试验 免疫扩散验
免疫电泳
火箭免疫电泳 对流免疫电泳
免疫浊度测定
1 抗原抗体比例
1. 高剂量钩状效应（high dose hook effect )
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
（二）类型
1. 透射免疫比浊法
通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光 线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。
2、散射免疫比浊法
通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度 来定量抗原抗体的复合物。
3、免疫胶乳比浊法
以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微 量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏 度。
1 透射免疫比浊法
概念：将现代光学测量仪器与自动化分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，可以 对各种液体介质中的微量抗原、抗体和 药物及其他小分子半抗原物质进行定量 测定。
（一）免疫浊度分析的基本原理：
• 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成 小分子免疫复合物(<19S)，在增浊剂(如聚乙 二醇( PEG)、NaF等)的作用下，迅速形成免 疫复合物微粒(>19S)，使反应液出现浊度。 在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度 亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度 呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同 时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出 标本中抗原的含量
第章 免疫沉淀试验
第章免疫沉淀试验1. 概述免疫沉淀试验（Immunoprecipitation，IP）是一种利用抗体识别并沉淀目标分子的方法，常用于生化研究中分离和富集特定蛋白质复合物或蛋白质与其结合的DNA或RNA。
该技术基于免疫学原理，利用抗体具有特异性结合的特点来选择性地富集目标蛋白质，进行蛋白质荷瘤、互作和定量分析等研究。
该方法在蛋白质组学、信号通路分析、基因表达调控等领域得到广泛应用。
2. 实验原理IP技术主要包括两个步骤：先配制抗体与其结合的固相载体，再将条件适宜的样品与载体中的抗体结合。
2.1. 抗体的选择抗体的选择是IP技术成功的关键。
其中最为关键的是抗体的特异性。
在选择时，需对要纯化的物质进行充分的了解，选出特异性良好的抗体。
同时，需考虑到其他相关蛋白质的影响以及抗体与其它宿主组织中的蛋白质的结合。
在实验中，一些常用抗体如抗Flag、acetylated lysine、His-Tag等，被广泛的用于IP实验。
2.2. 实验步骤步骤1配制包含抗体的固定相将抗体加到含有固定相的缓冲液中，可形成抗体定向固定相。
多数情况下，固定相都是用时反转半胱氨酸（Protein A）或静脉曲张病毒蛋白（Protein G）制备的。
这两种蛋白质都具有特异性，可结合某些种类的免疫球蛋白底部部分。
同种类的免疫球蛋白的Fc部分的结构是特异性的，因此结合蛋白可以选择性地紧密结合免疫球蛋白。
步骤2预清洗样品将样品加入预清洗液，使它们在悬浮状态下并分散其中。
缓冲液中必须包含适当的离子强度、pH值和抑制剂，以防止目标蛋白的脱落或结合于特定的固定相。
步骤3将样品与固相中的抗体结合将固相中的抗体加入预处理和静止的样品。
它们之间的相互作用确保了蛋白质与抗体的结合。
样品被置于洗涤步骤之前的固相中，以便抗体可以识别它的目标蛋白，并在固相上固定它。
步骤4洗涤将样品从固相中分离出来并进行洗涤。
此过程涉及多次缓冲液的加入和去除，以除去非特异性结合和非特异性背景噪音，同时保持目标分子的完整性。
血清学试验方法。
血清学试验方法。
以血清学试验方法血清学试验是一种常用的诊断和研究疾病的方法，通过检测血液中的抗体或抗原来判断机体免疫状态以及感染情况。
本文将介绍血清学试验的基本原理、常用的血清学试验方法以及其在临床和科学研究中的应用。
一、血清学试验的基本原理血清学试验基于机体免疫系统的特性，通过检测血液中的抗体和抗原来判断机体的免疫状态。
抗体是机体对抗原产生的一种特异性免疫应答物质，可以与抗原结合形成可见的免疫复合物。
血清学试验利用这种抗原与抗体的特异性结合关系，通过不同的方法来检测和测定血液中的抗体或抗原，从而获得有关机体免疫状态和感染情况的信息。
二、常用的血清学试验方法1. 免疫沉淀法：该方法利用抗原与抗体结合后形成的可见免疫复合物在溶液中的沉淀性质，通过观察沉淀现象来判断抗体和抗原的存在与否。
常见的应用包括免疫沉淀反应和双向免疫沉淀反应。
2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种高灵敏度、高特异性的血清学试验方法，常用于检测血液中的抗体或抗原。
该方法通过抗体与抗原结合形成复合物，再利用酶标记的二抗与复合物结合，最后通过底物的反应产生可见的颜色或荧光信号来定量检测。
3. 病毒中和试验：该试验主要用于检测抗体对病毒的中和作用。
通过将病毒与抗体混合后，观察病毒的感染和复制能力来判断抗体的中和效果。
病毒中和试验常用于病毒感染的诊断和疫苗效果的评估。
4. 血凝试验：该试验利用抗体与抗原结合后形成凝集反应，通过观察凝集现象来判断抗体和抗原的存在与否。
血凝试验常用于血型鉴定和某些感染性疾病的诊断。
三、血清学试验在临床应用中的意义血清学试验在临床应用中具有重要的意义。
首先，血清学试验可以用于疾病的早期诊断和筛查，如乙肝病毒感染的血清学检测可以早期发现感染者。
其次，血清学试验可以用于疾病的鉴别诊断，如通过检测自身抗体来判断自身免疫性疾病的类型。
此外，血清学试验还可以用于评估疫苗的效果、监测疾病的进展和判断治疗效果。
沉淀反应
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强：抗血清最核心的要求是单价特异性，即该抗体只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应，特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度代表真实的试验结果。
（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4）R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
(完整版)沉淀反应
沉淀反应沉淀反应特点：沉淀反应是指可溶性抗原和相应抗体在特定的条件下特异性结合所出现的沉淀现象。
沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素、核酸等可溶性的小分子物质。
一、概念可溶性抗原与其相应抗体特异结合，出现肉眼可见的免疫复合物，称为沉淀反应。
沉淀反应属于体外抗原抗体反应，其反应也分两个阶段：第一阶段位抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成大的可见免疫复合物，如沉淀线、沉淀环等。
二、液相内的沉淀反应液相内的沉淀反应类型有絮状沉淀反应、环状沉淀反应和免疫浊度试验。
1、絮状沉淀反应在电解质溶液中，可溶性抗原与相应抗体特异性结合，当抗原和抗体分子比例合适的时，可形成絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。
直接影响絮状沉淀的试验最重要的因素是抗原和抗体分子比例合适。
①抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗体反应②抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应③方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法（二维的，既稀释抗原也稀释抗体）2、环状沉淀反应先将适量已知抗血清价值毛细玻璃管（2~3mm）底部，再沿管壁缓缓加入等体积待测样品溶液，使样品与抗血清分层清晰。
如果样品中有与已知抗体对应的可溶性抗原，会在两种液体的交界面出现白色沉淀环。
3、免疫浊度试验⑴原理：在特殊缓冲液中，分子比例合适的可溶性抗原与相应抗体形成抗原抗体复合物，使反应液出现浑浊，其浊度与免疫复合物的量成正比，利用光学测量仪器结合自动分析检测系统检测，并与一系列的标准品对照，即可计算出被检抗原或抗体的含量。
免疫浊度法按照仪器设计的不同，分为使用透射比浊仪的免疫透射比浊法和使用散射比浊仪的免疫散射法。
免疫浊度法可用于液体中的微量抗原、抗体及小分子半抗原（如药物等）的定量检测。
其优点是自动检测、操作简便快速、适合大批量标本检测、灵敏度高（可达毫微克水平）、且无放射性污染。
A、免疫透射比浊法原理及用途：当抗原抗体特异结合形成IC时，溶液浊度增加。
浅析染色质免疫沉淀(ChIP)技术在DNA与蛋白质相互作用研究中的重要性
浅析染色质免疫沉淀（ChIP）技术在DNA与蛋白质相互作用研究中的重要性染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的一项强大技术，广泛用于多个领域的染色质相关蛋白的研究（如组蛋白及其异构体，转录因子等），特别适用于已知启动子序列或整个基因位点的组蛋白修饰分析研究。
这项技术采用特定抗体来富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，通过多种下游检测技术（定量PCR，芯片，测序等）来检测此富集片段的DNA序列。
ChIP技术自诞生之后，已成功的应用于人或动物细胞和组织[1] 、植物组织[2]、酵母[3] 以及细菌、质粒[4] 。
由于在信号转导和表观遗传研究中的突出作用，ChIP 在肿瘤[5-7]、神经科学[8-10]、植物发育[11-13] 等领域中应用非常广泛，同时有关细胞凋亡[14]、雌激素信号转导[15] 、胰岛素抵抗[16] 、组织发育[1]的文献中也用到ChIP。
目前，最常见的有以下两种ChIP实验技术：1. nChIP：用来研究DNA及高结合力蛋白，采用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）消化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于组蛋白及其异构体，例如[17-19] ；2. xChIP：用来研究DNA及低结合力蛋白，采用甲醛或紫外线进行DNA和蛋白交联，超声波片段化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于多数非组蛋白的蛋白，例如[9, 15, 20]。
X-ChIP试验的一般过程以上两种方法在分离DNA-蛋白质复合物之后，对DNA进行PCR扩增，验证目标序列的存在。
除验证实验外，ChIP DNA也可以进行测序分析，这种方法被称为ChIP-seq[22]；也可做芯片分析，这种方法被称为ChIP on CHIP或ChIP-CHIP[23] 。
这两种方法都可用于分析感兴趣蛋白结合的未知序列，而不需要知道目标序列的详细信息，因此可以进行探索性的研究。
当需要对DNA结合的蛋白复合物（两个或两个以上蛋白共同结合在DNA上）进行研究时，可以采用reChIP技术对DNA蛋白复合物进行再次富集，从而分析两种蛋白同时结合的DNA片段，例如转录调控因子及其受体复合物[24]。
应用放射免疫沉淀试验方法开展鼠疫血清学监测
２０ ５份鼠类血 清进 行 ＲＰ试验 ， 检 出鼠疫 Ｆ 抗体 ． ４ Ｉ 未 Ｉ
明 确 了相 应 地 区 近 年来 尚未 出 现 过 动物 鼠疫 流行 迹
作 者 单 位 ： 广 东 省湛 江 鼠疫 防 治研 究 所 （ 江 ５ ４ ３ ） ２ ｌ 湛 ２ ０ ７ ； ．广 东 省 湛 江 市 中心 人 民 医 院
参考文献
［］ 李岑字 ， ． １ 等 应用放射免疫沉 淀试验检测 鼠疫抗体的研 究 ［］ Ｊ．中华流行病学杂志．９ ９ １ （） １６ １ ８ ．０ ５ ：６ ． ［ｌ粱 练 ，等 ．Ｈ ２ Ｉ Ａ检 测 鼠疫 Ｈ 抗 体 的 一种 非 特异 性 反应
Ｊ．中国地方病防治杂 志．００．５ ５ ：０ 】 ２０ １ （） ３ ８ （ 收稿 Ｅ期 ：ｏ １ ８ ２ ） ｌ ２（ —０ — ８ ｝
大监 测的力度 ，着 重病 原学 方面 的研究 ，发挥实 验诊
断 的有效作用 。
表 １ 鼠娄 血 清 Ｒ Ｐ试验 统计 Ｉ
３ 小 结 几 年来 ， 广 东河 源 、 丰 、 宁和 电 白 ３市 １ 对 陆 普 县
象 。由于广东是 沿海 开放 窗 口．存 在着 外界 鼠疫传 人 或 旧疫 源地 复发诸 因素 的威胁 ，所 以时 刻不 能放松 警 惕 ，在监测上要 把好技 术 和质 量关 ，提 高实 验诊 断方
测试仪 器 ：Ｎ ６２ Ｓ － ８ Ｂ型 免疫 测量 仪 。中 国科 学
院上 海原子 核研 究所 、上海台 福光 电仪器 有 限公 司产
品。
试验 方法 ：被检血 清 经过 ５ ６℃ ３ ｎ灭 活后 初 ０ｍｉ 试， 达到反 应标 准进行 三排 复试 ． 并设 阴性 、 阳性和 空 白对 照。具 体操 作方 法按使用 说 明 书。 阳性判定 标 准 ：三排 复试 能抑制 反应 滴度 ３管 以
临床免疫学检验-第五章凝集反应和沉淀反应
Radial Immunodiffusion (RID)
Two methodologies of RID
Fahey method A linear relationship
exists between the log of the protein concentration and the diameter of the precipitin ring prior to equivalence (or completion)
FIGURE 6-5 Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible
Ability of a test to correctly identify individuals who HAVE a given disease/condition
How likely is the test to detect the presence of a characteristic in someone with the characteristic?
简单易行 特异性好 灵敏度低(10µg/ml) 时间长
免疫电泳技术
免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是可溶性抗原和抗体在直流电场 的作用下，在凝胶内加速定向运动，彼此相 遇结合，在比例合适处形成可见的沉淀物。
免疫电泳技术
免疫学实验技术
免疫学实验技术
免疫学实验技术是一种用于研究和分析免疫系统的实验方法。
它涉及到各种技术和手段，用于检测、分析和研究免疫细胞、免疫分子以及免疫反应。
其中一些常见的免疫学实验技术包括：
1. 流式细胞术：这是一种用于对单个细胞进行高速分析和分选的技术。
它可以用于检测细胞表面标志物、细胞内蛋白质、细胞功能等。
2. 免疫组织化学：该技术用于检测组织样本中的特定抗原或蛋白质。
通过使用特异性抗体与组织中的目标抗原结合，然后通过显色或荧光染料进行可视化。
3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：这是一种常用的检测体液中特定抗体或抗原的技术。
ELISA 利用抗体与抗原的特异性结合，并通过酶催化的显色反应来定量检测目标分子。
4. Western blotting：该技术用于检测蛋白质样本中的特定抗原。
它通过电泳分离蛋白质，然后将其转移到膜上，再使用特异性抗体进行检测。
5. 免疫沉淀：这是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
通过使用特异性抗体捕获目标蛋白质，然后通过沉淀和分析来确定与其相互作用的其他蛋白质。
6. 细胞培养和功能分析：免疫学实验常涉及细胞培养，如淋巴细胞的激活、增殖和功能测定，以研究免疫细胞的行为和应答。
这些技术在免疫学研究、疾病诊断、药物开发等领域都有广泛的应用。
随着技术的不断发展，新的免疫学实验技术也在不断涌现，为深入了解免疫系统的功能和机制提供了更多的手段和工具。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；2.Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.3.4. 2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；5.Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).6.7. 3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的管中。
环卵沉淀试验名词解释
环卵沉淀试验名词解释
环卵沉淀试验（Circulating immune complex assay，CIC）是一种检测体内循环免疫复合物（CIC）水平的方法。
循环免疫复合物是指由抗原和抗体结合形成的复合物，它们在血液循环中存在并参与多种疾病的发生和发展。
环卵沉淀试验是通过将血清样品与卵清白蛋白（BSA）结合，形成免疫复合物，然后使用聚乙二醇（PEG）沉淀这些复合物，最后测量剩余的游离BSA浓度，从而确定循环免疫复合物的水平。
环卵沉淀试验可以用于多种疾病的诊断和监测，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肝炎、艾滋病等。
它可以帮助医生评估疾病的严重程度、预测疾病的进展和治疗效果。
但是，环卵沉淀试验也存在一些局限性，如对某些类型的循环免疫复合物不敏感、结果受到抗体和抗原的影响等。
总之，环卵沉淀试验是一种重要的免疫学检测方法，可以帮助医生了解循环免疫复合物的水平，从而更好地诊断和治疗疾病。
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沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳技术
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
应用
1.AFP检测的最早方法
2. 血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点：
1. 加快反应的速度。 2. 提高了灵敏度。
3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
?电泳（electrophoresis） ：在外加
伪浊度形成的原因
1. 抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2. 增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3. 样品本身的浊度处理不当 4. 试剂污染变质 5. 比色杯不够清洁
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中 扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 相遇并且浓度比例适当的位置形成 肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
一、单向免疫扩散试验
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀 环
Mancini曲线
Fahey曲线
T1 为16-24h；T2为24-48h；T3为48h 以上,可见T3为直线，T1为反抛物线
t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
（2）抗体的质量
?抗体的特异性 ?抗体的效价(>1:20) ?抗体的亲和力 ?R型和H型抗体（R型）
（3）抗原抗体反应的环境 最适PH 为：6.5-8.5 离子强度大， IC 形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000 —8000) 浓度4%吐温-20
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
二、免疫浊度测定
原理： 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，
二者比例合适时，在增浊剂中它们 快速形成一定大小的抗原抗体复合 物，使反应液体出现浊度。
优 点：
?稳定性好、简便快速，易于自动化 ?敏感度高 ?精确度高 ?无放射性核素污染
分 类：
1. 根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2. 根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验
电场的作用下带电颗粒向着其电性相
反的电极移动，称为电泳。
? 电泳迁移率： 定义：同一电场条件下，各种带电粒子在
单位时间内移动的距离。M=cm 2/VS
影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH 值 溶液离子强度 电渗
?电渗： 电场中液体相对于固体的运动
①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压
电渗方向与样品运动方向一致： 样品迁移率加快
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
?电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度： 0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝 固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。
?蛋白质的两性解离性质：
--NH 2 + H 2O
--NH
+ 3
反应介质：凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab 复合物网络在凝胶
中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理：抗体与待测的抗 原,在两者比例合适的 部位结合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓 度成正相关。
技术要点：
1. 制板 2. 打孔 3. 加样 4. 扩散 5. 绘制标准曲线
+
OH
-
--COOH
第六章 免疫沉淀试验
教学目的
?掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
?熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理 免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉 淀现象。
I
检测器A
I0
θ
当复合物＜ 3×106dal ，
I≈Iθ;θ ＜90°，散射光的
量代表 IC 的量。
Iθ 检测器B
散射比浊试验
补充：免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强，并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH 为6.5-8.5 （4）增浊剂
待检蛋白质抗原须具备的条件
?仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 ?已知含量的标准品 ?待测品含量在1.25 ? g/ml 以上
一、单向免疫扩散试验
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清
应用
IgG、IgA 、IgM 、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
等多种血浆蛋白的检测
二、双向免疫扩散试验
技术要点： 1. 制板 2. 打孔 3. 加样 4. 扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 2.分析抗原或抗体相
以及估计相对含量
对分子量
二、双向免疫扩散试验
3. 分析抗原的性质
二、双向免疫扩散试验
4. 滴定抗体的效价 5. 鉴定抗原或抗体 纯度
第二节 液体免疫沉淀试验
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合，在电解质存在的条件下， 抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示意图