免疫共沉淀与Western Blot
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
免疫共沉淀法 (2)
免疫共沉淀法
1.将准备用来做western blot 的样品用Nanodrop 测出蛋白浓度，留下50ul加入电泳的
loading buffer 后封口膜封口，玻璃杯装入一定体积的水烧开后，关火，放入上述样品，余温5分钟后，取出，放入4℃冰箱备用。
而另一部分根据各个样品的浓度，在EP管中配制成200ug（ug / ul×ul ）的体系，然后再分别加入20ul protein A/G plus（每次使用前需先混匀）4℃,30 min
2.取出，离心2500 r/min ,4℃,5min
3.转移离心后的上清于新的EP管中，加入0.5ug T-bet(量与样品量相关,200ug样品一
般加0.5ug T-bet )，4℃,1h，再加入20ul protein A/G plus Agarose , 4℃，摇床上振摇过夜
4.再次取出，离心2500 r/min ,4℃,5min
5.弃上清，沉淀用1ml RIPA 或PBS洗4次，洗好后，加入一定比例的loading buffer 后
封口膜封口，玻璃杯装入一定体积的水烧开后，关火，放入上述样品，余温5分钟后，取出，放入4℃冰箱备用。
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种重要的分子生物学技术，用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用。
其基本步骤包括抗体与靶分子的结合、沉淀复合物以及检测目标分子。
在免疫共沉淀实验中，检测结果需要经过多种方法进行解读，常用的方法包括：
1. Western blot分析：将分离的蛋白质进行电泳，然后用抗体检测目标蛋白质，以验证免疫沉淀所得到的目标蛋白质是否为所需的蛋白质。
2. 质谱分析：通过质谱技术分析免疫沉淀所得到的复合物，识别其中的蛋白质成分，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
3. 透射电镜分析：通过透射电镜技术观察免疫沉淀所得复合物的形态结构，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
4. 免疫共沉淀重复试验：通过多次重复免疫共沉淀实验，验证结果的可重复性和稳定性，评估实验的可靠性和准确性。
综上所述，免疫共沉淀实验的结果需要通过多种方法进行解读，确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况，从而深入研究其功能和调控机制。
Protocol集中营，你值得拥有！
Protocol集中营，你值得拥有！作者：解螺旋.子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手·导语·实验protocol往往是科研汪们行走江湖时必备的武林秘籍，且一份真正靠谱的protocol绝对是神兵利器。
而在免疫学研究之势如火如荼的今天，其实验手段更是五花八门，让人眼花缭乱。
那么现在小鱼就把免疫学上最常用的基础实验（western blot、免疫共沉淀、免疫组化及ELISA）的protocol介绍给大家。
Western blot（WB）WB是用特异性抗体对PAGE电泳的蛋白质样品进行着色，并通过分析着色的位置和深度来获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
（回复关键词“WB”，可查阅WB经验大盘点的文章，关键词回复的正确姿势请点击这里）Protocol：1 从细胞中提取蛋白，并测定蛋白浓度含量。
2 取适量蛋白液与loading buffer（含有SDS和β-巯基乙醇）混合，加热煮沸5min，使蛋白变性后与SDS结合携带负电。
3 将变性蛋白进行SDS-PAGE胶电泳。
在电压的作用下，带负电的蛋白质由上向下在凝胶里移动，且蛋白的分子质量越大，其迁移率越慢。
4 转膜：通过半干法或湿转法将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜或PVDF膜上。
5 免疫印迹：封闭&敷抗体。
6 检测方法免疫共沉淀免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合及细菌的Protein A或G特异性结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象，将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。
该实验共包括了3种类型：IP（如染色体免疫共沉淀CHIP）、Co-IP和PulldownIP是只利用抗体抗原的特异性结合即可将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。
其中，CHIP便是由IP技术衍生而来。
（回复关键词“CHIP”,可查看相关文章，关键词回复正确姿势请点这里）Co-IP是在细胞非变性裂解时，蛋白之间的相互作用被保留下来，如果蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
1）是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
2）Western blotting
蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。
与免疫组化技术相比，定量可能更加准确;当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。
3）ELISA
酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。
与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。
westernblot原理及步骤
Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。
加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。
移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。
上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。
【具体方法】2.电泳（Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
Western Blotting及免疫共沉淀操作步骤
Western Blotting及免疫共沉淀操作步骤1 材料、试剂1.1 材料人胚胎肾细胞HEK 293T购自上海生科院细胞资源中心，带Myc标签的真核表达载体pCMV-Myc 和带HA(hemagglutinin) 标签的真核表达载体pCMV-HA、抗Myc小鼠单抗、抗HA兔多抗购自Clontech。
辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔、羊抗小鼠二抗为武汉博士得公司产品。
ECL超级发光液购自北京普利莱基因技术公司，脂质体转染试剂Lipofect Transfection (RM201-1)、Bradford蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，预染蛋白Marker 购自New England BioLabs（分子量范围6.5-175Kda），DMEM培养基及无血清培养基OPTI-MEM购自Invitrogen。
其它常规试剂为进口分装或国产分析纯。
胎牛血清为杭州四季青产品。
1.2 试剂1）30%Acr(丙烯酰胺)-Bis（甲叉双丙烯酰胺）Acr 29.2gBis 0.8g37℃,溶于60ml去离子水中，定容至100ml，确定pH<7，4℃棕色瓶保存（保质期30天）。
注意：戴手套操作2）10%（W/V）SDSSDS（电泳级）10g双蒸水90ml68℃溶解，浓HCl调pH 至7.2，定容至100ml，室温保存。
3）1.5M Tris, pH8.8Tris base(三羟甲基氨基甲烷) 18.15g双蒸水80ml溶解后，浓HCl调pH 至8.8，定容至100ml，灭菌、4℃保存。
4）0.5M Tris, pH6.8Tris base(三羟甲基氨基甲烷) 6g双蒸水60ml溶解后，浓HCl调pH 至6.8，定容至100ml，灭菌、4℃保存。
5）10% AP(过硫酸铵)AP 0.100g双蒸水1ml溶解后，50μl分装后，-20℃保存。
6）0.5%(W/V) 溴酚蓝溴酚蓝0.0050g双蒸水1ml溶解后，室温保存。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
有多种方法可以检验蛋白质与蛋白质相互作用：
1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）：通过抗体选择性地沉淀出蛋白质复合物，并利用Western blot等技术检测相互作用蛋白质的存在。
2. 蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography）：将一个蛋白质固定于树脂上，然后通过蛋白质与其交互作用的其他蛋白质在层析柱中保留，并通过洗脱和分析来确认相互作用。
3. 光敏交联（photocrosslinking）：通过使用光敏交联剂，使两个相互作用的蛋白质发生共价化学反应，并通过分子量分析等技术来确定相互作用。
4. 双杂交实验（yeast two-hybrid assay）：利用酵母中的转录激活子结构域和DNA结合结构域的解偶联来检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5. 表面等离子共振（surface plasmon resonance）：利用传感器芯片上吸附的一个蛋白质通过流动相与另一个相互作用蛋白质进行实时监测，并测定其结合亲和力和动力学参数。
这些方法都能有效地检验蛋白质与蛋白质相互作用，具体选择哪一种方法还需根据实验目的和条件来决定。
免疫沉淀和免疫印迹
免疫沉淀和免疫印迹免疫沉淀和免疫印迹（Western Blotting）在细胞生物学研究中，有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产物进行定性或／和定量。
但由于靶蛋白表达水乎不太高，用细胞裂解液或表达上清进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（Western blot）检测很难达到实验目的。
为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀，纯化和富集靶抗原。
免疫沉淀所获得的蛋白可进行SDS－PAGE电泳，经考马氏亮蓝染色或银染后观察目的蛋白条带。
如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限，可采用Western blot检测方法，提高检测的灵敏度，达到实验目的。
免疫沉淀（一）原理免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A ／G（Protein A／G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗体－目的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5－10 min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
（二）试剂1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml双蒸水中，用HCl调PH至7.4，在补加水至1L，高压灭菌后保存于室温。
2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml双蒸水中，再补加水至100 ml，高压灭菌。
3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris碱，溶于80 ml双蒸水，用HCl调 pH至7.5，再补加水至100 ml。
4．蛋白酶抑制剂：Aprotinin和Leupeptin溶于双蒸水，PMSF 溶于异丙醇，浓度均为10 mg/ml。
5．N-40：10％（w／V）。
6．脱氧胆酸钠：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。
验证两个蛋白互作的实验方法
验证两个蛋白互作的实验方法
1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），这是一种常用的方法，通过将一种蛋白的抗体与另一种蛋白结合，然后使用蛋白
A/G琼脂糖或其他亲和层析介质来沉淀出这两种蛋白的复合物，最后通过Western blot等方法检测是否存在互作。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid），这是一种体外的方法，利用酵母细胞内的转录因子结合域和激活域的相互作用原理，来检测两种蛋白是否可以相互结合。
3. 荧光共定位（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），这种方法通过在两种蛋白上分别连接荧光蛋白，当这两种蛋白发生互作时，荧光蛋白之间的距离会改变，从而可以通过激发和发射光谱的变化来检测它们之间的互作。
4. 质谱法（Mass Spectrometry），这是一种高通量的方法，通过将蛋白复合物进行分离和鉴定，可以直接检测到蛋白之间的相互作用。
5. 共定位实验（Co-localization Assay），通过荧光共定位
实验或者免疫荧光染色等方法，可以观察两种蛋白在细胞内的共定位情况，从而推测它们之间可能存在的互作关系。
总的来说，验证两个蛋白互作的实验方法有很多种，研究人员可以根据具体的实验目的和条件选择适合的方法来进行验证。
这些方法在生物医学研究中起着至关重要的作用，有助于揭示蛋白之间的相互作用关系，进而深入理解细胞内的生物学过程。
IP与IB
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非特异条带多
原因
抗体浓度过高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现 交叉反应
对 策
杂交前检测一抗、二抗 的工作浓度 转膜前用100%甲醇将 膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴 手套，更换新鲜转膜缓 冲液 检测一抗、二抗与封闭 剂是否有交叉反应
41
哑铃型条带或 “微笑” 条带
原因
上样体积过大导致 不完全堆积 电泳过程中电场不 均匀 分离胶表面不齐
使用恰当上样体积
如果蛋白浓度已知，上样
时确保对称
对 策
制胶时使分离胶表面水平
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无条带的原因
蛋白样品制备
检查胶：考马斯亮蓝染胶 检查膜：丽春红S染色 抗体滴度太低 显色 试剂放置太久或存放条件不正确
23
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O
24
灌制浓缩胶
插入梳子
25
SDS-PAGE电泳
26
样品的印记--转膜
半干转移法
将凝胶和固相基质象三明治一样夹在 用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
槽式湿转法
将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸 泡在转移装置的缓冲液中。 － |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|＋
13
7．琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次； 最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸 水煮5分钟，离心收集上清。上清中含有 目的蛋白和抗体； 8． sds-page, western blotting或质谱 仪分析。
14
注意事项
1、免疫共沉淀实验成功与否，第一步处理 样品非常关键。免疫共沉淀实验本质上 是处于天然构象状态的抗原和抗体之间 的反应，而样品处理的质量决定了抗原 抗体反应中的抗原的质量以及抗原是否 处于天然构象状态。在这个环节中，除 了要控制所有操作尽量在冰上或者4℃上 完成外，最为关键的是裂解液的成份。
免疫沉淀法和Western印迹实验
免疫沉淀法和Western印迹实验如题，发一个关于免疫沉淀法和Western印迹实验的资料:免疫沉淀法和Western印迹实验1）抗原制备1．取5×107细胞，用TBS（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 138mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl）洗涤，用1ml含1mmol/L PMSF的TNB（1％ Nonider P40, 1mg/ml BSA, TBS配制）悬浮沉淀细胞，置冰上30～60分钟，溶解细胞。
2．强烈混悬10秒钟（涡旋器），250×g离心10分钟，去除沉淀的细胞核。
微量离心机最大速度（每分钟14 000转）离心上清液30分钟或100 000×g离心30分钟，去除沉淀物。
上清液用于免疫沉淀。
2）免疫沉淀1．每200μl抗原制剂中加入10μl兔血清-Agarose和10μl山羊血清-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去除沉淀的Agarose 小珠。
2．将含抗原的上清液分成两等份，分别置1.5ml离心管中，各加TNB到1ml。
一管中加1～5μl兔抗细胞因子抗血清（或1～5μl小鼠单克隆抗体腹水或50～100μl含特异性抗体的杂交瘤细胞培养上清液），另一管加入同样量的对照液（无特异性抗体的同种属血清、腹水和细胞培养上清液），4℃结合1～2小时。
3．每管加50μl第二抗体-Agarose（例如山羊抗兔IgG的抗体与Agarose的结合物）或者葡萄球菌蛋白A（或G）-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去上清液。
4．用TNB洗涤沉淀物2次、TBS洗涤沉淀物2次，每次用1ml液体，混合后200×g 离心5秒钟，去上清液。
加入1ml 50mmol/L pH6.8的Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀物，将悬液转移到新的离心管中，200×g离心5秒钟，最后小心吸去全部液体。
WesternBlot蛋白免疫印迹原理实验步骤流程WBFAQ@德泰生物
WesternBlot蛋白免疫印迹原理实验步骤流程WBFAQ@德泰生物Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
Western Blot实验试剂及仪器1.试剂准备（1）甲醇（2）转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）（3）一抗，二抗（4）PBST，PBS，Tween-20（5）显影液（5X）：自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔1.55g，亚硫酸钠（无水）22.5g，碳酸钠（无水）33.75g，溴化钾 20.95g，补水至 500ml（6）定影液：自来水（50～60℃）700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g，亚硫酸钠（无水）15g，冰乙酸12.6ml，硼酸7.5g，钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入），加水定容至 1000ml，室温保存2. 材料准备转膜用的夹子，两块海绵垫，一支滴管，两张滤纸，一张PVDF 膜，转膜槽，转移电泳仪，摇床，计时器，磁力搅拌器，转子，Western blot 盒，一块SDS-PAGE胶，脱脂奶粉实验步骤(一) 配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)
（4）IgM 抗体的检测
1）间接法：
间接法 ELISA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清
中的 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而
使一部分 IgM 抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗 IgM 作为二抗，
单克隆抗体＋单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固 相载体和制备酶结合物。 用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其 不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。 双抗体夹心法测抗原的方法： 捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含 0.1％Tween 的 PBS)→酶标单抗或
1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，然后与能特异性 识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特 异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入 适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带 的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 2 操作过程 SDS-PAGE 电泳→转膜（PVDF 或硝酸纤维素膜） 封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应 洗涤→显色或化学发光显影
Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用 SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性 PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine 胶中电泳：用于分子量小于 10kDa 的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离 效果。 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝 胶大小一致 以适量的转移 Buffer 室温平衡滤纸、凝胶和膜 15－30min，如果是 PVDF 膜，必须先用甲 醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰 染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 用 5％脱脂奶粉或 3％BSA （含 0.1％Tween20 TBS 或 PBS 配制） 时间：室温 2h 或 4ºC 过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为 DAB 碱性磷酸酶：底物为 BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含 Tween20 的 TBS 或 PBS 洗涤一次曝光的时间和显影的时间根
IP与IB
10
Co-Ip操作步骤
1．离心收集细胞，PBS洗涤2次。细胞用 量根据目的蛋白表达的水平而定，一般 用 1×107－5×107细胞。 2．加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）， 于冰浴上超声破碎，然后再冰浴 30 min 。
3．4℃ 12000rpm离心 10 min后取上清 液。
11
• PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml双蒸 水中，用HCl调PH至7.4，在补加水至1L ，高压灭菌后保存于室温。 • 细胞裂解液：50 mM Tris（pH 7.5）、 150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、 l％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠。 • 蛋白酶抑制剂：Aprotinin和Leupeptin 溶于双蒸水，PMSF溶于异丙醇，浓度均 为10 mg/ml。
免疫共沉淀与免疫印迹
Co-Immunoprecipitation And Immunoblotting
1
一、概念 免疫共沉淀 免疫印迹 两者之间的联系
2
免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation，Ip）
利用抗原抗体特异性反应纯化富集目 的蛋白的一种方法。 这种方法常用于测定两种目标蛋白质 是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
36
Western Blot常见问题分析
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背景太高
原因
抗体浓度过高 封闭不充分 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污 染 抗体与封闭剂出 现交叉反应
对 策
杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度 延长封闭时间或更换封闭 液 转膜前用甲醇将膜完全浸 湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应
免疫共沉淀与 Western Blot
免疫共沉淀与Western Blot实验步骤:1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。
2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。
3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。
4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。
另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用；2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。
4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。
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免疫共沉淀与Western Blot
实验步骤:
1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。
2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。
3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。
4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。
另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：
1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用；
2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；
3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。
4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。
5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。
6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。
7．封闭完毕，用TBST洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75rpm）1小时，使一抗与特异蛋白结合。
8．回收一抗，用TBST洗3次（75rpm），每次5－10分钟。
9．加入二抗，于脱色摇床孵育1小时，使二抗与一抗结合。
10．用TBST洗3次，每次5－10分钟。
11．将ECL A液和ECLB液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF膜30秒，将PVDF膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X光胶片曝光。
12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker便于分析。
注：如只做Western Blot，跳过步骤4即可。
实验试剂：
1．PBS：
NaCl20mM,KCL2.68mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.76mM(pH7.4)，室温保存。
2．1×lysis buffer：
Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,Triton X-1001%,Sodium pyrophosphate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaVO4 1mM,Leupeptin1ug/ml,－20℃保存。
（稀释成1×lysis buffer后加入1mM PMSF）
3．2×SDS sample buffer：
Tris-Cl（pH6.8）125mM，SDS4%，甘油20%，DTT100mM，溴酚兰0.02%，室温保存。
4．分离胶（下层胶）（10%SDS-PAGE）15ml：
30%丙烯酰胺5ml，10×lower buffer(pH8.8)1.5ml，H2O8.5ml，10%AP15μl，TEMED15μl。
5．10×lower buffer(pH8.8)100ml：
42.25g Tris base，10ml10％SDS，室温保存。
6．压缩胶（上层胶）（4%SDS-PAGE）5ml：
30%丙烯酰胺0.65ml，4×stacking buffer(pH6.8)1.25ml，H2O3.05ml，10% AP5μl，TEMED5μl。
7．4×stacking buffer(pH6.8)100ml：
6.06Tris base，4ml10％SDS，室温保存。
8．电泳缓冲液：
Tris base0.125M，甘氨酸0.96mM，SDS0.5%，室温保存。
9．电转缓冲液：
Tris25mM，甘氨酸0.2mM，甲醇10%，室温保存。
10．10×TBS(pH7.6)：
Tris base2.42%，NaCl8%，室温保存。
11．TBST：
1×TBS，Tween-200.1%，室温保存。