WB免疫印迹实验常见问题全汇总

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WB免疫印迹中常见问题和解决方法1电泳中常出现的一些现

WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长减少曝光时间。

3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。

●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

WB发光检测中常见的问题及解决方法

WB发光检测中常见的问题及解决⽅法免疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。

其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。

疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。

其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋⽩质在电⼒场的作⽤下，由⼤到⼩的进⾏排列，利⽤电泳进⾏分离和富集。

拥有抗原表位的蛋⽩质分⼦被抗体（⼀抗）特异性识别并与之结合。

在此基础上，酶或荧光标记的⼆抗识别并结合⼀抗，通过与底物反应显⾊来观察⽬的蛋⽩。

Western blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：⼀、放射⾃显影，⼆、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈⾊。

现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊。

⼤部分Western blot显⾊底物是化学发光底物，发表⽂章通常也是⽤底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁⽶诺（lumino，氨基苯⼆酰⼀肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增⼤1000倍，通过将印记放在照相底⽚上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

ECL法操作简便，应⽤现成的试剂盒，按照说明，将两种显⾊底物等体积混合后将其覆盖在膜表⾯使其均匀，⽤玻璃胶⽚把膜包起来，马上在暗室中将X光⽚覆盖在膜的上⾯，显影、定影（或⽤荧光检测仪检测）。

ECL法具有灵敏度⾼，线性范围⼴等特点。

WB实验常见问题与解决方案讲座

含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源：一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
抑制剂名称
作用
PMSF
抑制丝氨酸蛋白酶
EDTA
抑制金属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白肽酶等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
抗体的交叉反应：交叉反应：有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应。
例如：你想做人和大鼠的实验，那么就希望买的抗体可以同时针对人和大鼠，相反如果有人只做一个种属的试验，那么可能就希望抗体的特异性更高点，那么就和其他种属的交叉反应越少越好

wb实验过程中的各种问题和解决方法

wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。

1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。

解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。

-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。

-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。

2.染料在染色过程中不均匀。

解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。

-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。

-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。

3.染色结果不明显。

解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。

-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。

-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。

-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。

4.细胞在染色过程中丧失形态。

解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。

-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。

-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。

5.染色结果有杂质。

解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。

-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。

-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。

6.染色结果无法观察到。

解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。

-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。

-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。

在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。

2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。

3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。

4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。

Western Blotting 各种问题及解决办法

问题
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存在
4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施降低抗体（一抗/二抗）浓度比较不同封闭液根据不同的体系优化封闭液提高封闭物浓度优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测增加清洗次数及清洗液体积如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润更换新膜确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子每一步孵育都应确保充分重新配制缓冲液降低抗体（一抗/二抗）浓度比较不同封闭液根据不同的体系优化封闭液提高封闭物浓度优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子更换新膜确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉每一步孵育都应确保充分膜过多时，应避免相互堆叠操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应使用新的缓冲液用前过滤确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染确保转膜后膜上没有残留的胶转膜结束后，染胶以确定转膜效率转膜时胶与膜应充分接触确保转膜时滤纸与膜装配正确按厂商指导将膜充分浸润

WB过程中常见问题及处理方法

2、制胶根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留的胶。玻璃板底部放平，尽量不能漏胶灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形
3、封闭封闭液的选择；封闭条件优化；
……
4、漂洗漂洗液的配制与选择漂洗时间及次数
5、抗体孵育抗体及稀释液选择；抗体稀释倍数优化；抗体孵育时间； ……
6、曝光曝光时间的掌控
四、注意事项
• 1.蛋白样品的提取
尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）选择合适的裂解液准确定量（BSA标准蛋白）
• b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体
分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化
• c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉
作为封闭剂
5、孵育
• a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降
低背景；
• b注意一抗二抗的匹配
• c一抗二抗的效价问题
五、常见问题及解决
电泳中的问题︶条带呈笑脸状 ——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;
——电泳系统温度偏高
• ︵条带呈皱眉状
可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
拖尾样品溶解不好
• 纹理（纵向条纹）

WB实验问题解决方案

没有信号
抗体浓度太低
1.优化抗体的使用浓度。
二抗种属问题
1.确保二抗能够识别所用的一抗
使用的一抗是天然蛋白免疫制备的
1.天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别变性的蛋白，检查抗体的厂家信息，确保可以用来检测你的目的蛋白。
检测试剂过期
1.确保检测试剂的有效期，设置阳性对照。
空白带
信号太强，底物被消耗
1.降低抗体浓度或者蛋白上样量。
2.跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚蓝会干扰荧光信号。
3.当使用Cy3标记的二抗时，使用Tween-20作为去污剂，TritonX-100会干扰Cy3的荧光信号。
4.洗涤最后一步使用PBS或者TBS去除去污剂。
Multiplex问题
与实验设计相关
1.确保二抗能有效地分开不同种属的一抗。
斑点背景
膜上有灰尘污染/圆珠笔做记号
4.对于单抗或者高度纯化的抗体，封闭液中不含去污剂效果会更好。
5.优化洗涤的次数降低信噪比。
6.如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷酸的缓冲液（如PBS）
过度封闭
1.室温封闭不超过1hr或者低温4度过夜。
曝光时间过短
1.延长曝光时间
抗体结合时间不够或者温度不合适
1.一抗或二抗在室温通常结合1-2小时，时间过短容易导致弱信号
转印buffer中甲醇浓度太低
1.提高甲醇的浓度（15%-20%）
蛋白结合时间不够
1.调低电压，延长转印时间。
分子量大的蛋白转印效率低
甲醇浓度太高
1.降低甲醇浓度至10%（V/V）以下。
蛋白结合时间不够
1.使用湿转代替干转。
2.延长转印时间。
蛋白凝胶浓度太高
1.降低凝胶浓度

WB常见问题及处理方法

WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。

没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。

封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。

一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。

抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。

4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。

组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。

转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。

洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。

过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。

激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。

WB实验常见问题与解决方案

应用：广泛用于检测蛋白水平的表达
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源：一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好是是 WB, IP
很好是是 WB, IP
很好是是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基本原理示意图
红色箭头：目标抗原绿色箭头：靶抗体黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基本过程示意图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置全细胞
胞浆（可溶性蛋白）

WB过程中常见问题和处理方法

5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合过滤封闭剂
放映结束感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性
拖尾样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡 20min；

WB过程中常见问题及处理方法

4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应
——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 5、洗膜不充分
——增加洗涤次数，增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱 1、一抗、二抗等不匹配 • 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二
•
抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性更换更好的一抗二抗
2、制胶根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留的胶。玻璃板底部放平，尽量不能漏胶灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜 a 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形
3、封闭封闭液的选择；封闭条件优化； ……
4、漂洗漂洗液的配制与选择漂洗时间及次数
5、抗体孵育抗体及稀释液选择；抗体稀释倍数优化；抗体孵育时间； ……
6、曝光曝光时间的掌控
四、注意事项
• 1.蛋白样品的提取
尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）选择合适的裂解液准确定量（BSA标准蛋白）
2、一抗或/和二抗浓度低增加抗体浓度；长孵育时间；
3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 • 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20 • 更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶）
4、样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过 • 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没
有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目

Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
Western blot发光检测中常见问题及解决办法
现象
原因
解决办法
信号弱或无
背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。

WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。

以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。

WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。

2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。

3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。

4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。

5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。

6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。

但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。

Western Blot常见问题及解决方法

Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。

然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。

•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。

•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。

2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。

•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。

3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。

•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。

•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。

4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。

•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。

5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。

•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。

6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。

•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。

•检查显影液是否过期或存在质量问题。

7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。

•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。

•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。

8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。

蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答

蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。

（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

western免疫印迹的注意事项

western免疫印迹实验流程和蛋白条带的注意事项一、条带中所遇到的情况1. 完全没有条带完全没有条带的原因主要有以下4点：（1）抗体加错（最常见一抗加错抗体，或二抗种属加错）。

（2）转膜出现了问题（常见膜放反）。

（3）发光液失效或不够灵敏。

（4）蛋白上样量过少，一抗浓度太低2. 目的条带有但高背景高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景，主要原因：（1）洗膜时间和次数不够（常用10min*3）。

（2）封闭不够好。

（3）一抗浓度过高，可通过调整一抗浓度来降低背景。

3.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过，在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。

注意与高背景区别。

4.背景出现黑点由于封闭时牛奶不纯，没有完全溶解致使颗粒残留，同时封闭后清洗不完全，也会导致背景出现黑色斑点。

5.条带上有白色小点由于电转中膜和胶之间存在气泡，转膜时一定要将气泡都去除。

6.非特异性条带主要由于一抗非特异性与蛋白结合，建议更换抗体。

7.条带拖尾主要原因：（1）蛋白量太大。

（2）一抗浓度过大，孵育时间太长。

8.条带呈哑铃状（1）胶在配置过程中未冷却完全，胶不够均一。

（2）样品中含有太多杂质，没有离心下来，杂质沉积在孔的中间。

9.电泳中出现问题（1）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳时电压过大发热，应该降低电压或者冰浴。

（2）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。

（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。

二、内参的选择1. Actin，Tubulin，GAPDH都为最常用的内参抗体，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，GAPDH与前两者相比比较稳定，建议选择。

Western免疫印迹常见问题解答赛信通生物试

Western免疫印迹常见问题解答赛信通生物试做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。

抗体稀释在含5% 的w/v BSA或1X TBS, 0.1% Tween-20的脱脂奶粉当中。

注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液和稀释比例。

A．所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS):(#9808) 配制1L 1X PBS时，取50ml 20X PBS用950ml RODI水稀释到1L，混匀。

2. 1X SDS 上样缓冲液：(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。

3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。

4. 10X Tris缓冲盐水(TBS):配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。

5. 脱脂牛奶:(#9999) (重量体积比[w/v])6. 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。

配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。

7. 洗液:1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。

8. 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA): (#9998).9. 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。

配20ml时，在18ml水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。

WB 过程中常见问题1

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

WB 实验中常会出现各种问题问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议4℃ 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。

可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。

洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。