WB免疫印迹实验常见问题全汇总
WB免疫印迹中常见问题和解决方法1电泳中常出现的一些现
WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
wb实验过程中的各种问题和解决方法
wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。
1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。
解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。
-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。
-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。
2.染料在染色过程中不均匀。
解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。
-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。
-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。
3.染色结果不明显。
解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。
-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。
-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。
-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。
4.细胞在染色过程中丧失形态。
解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。
-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。
-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。
5.染色结果有杂质。
解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。
-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。
-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。
6.染色结果无法观察到。
解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。
-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。
-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。
在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。
2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。
3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。
4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。
免疫印迹中的问题
我做的WB中检测两个目的基因，一个是90kd，一个是42kd，内参是36kd，请问一下我这个怎么做才有可比性，后面一个目的蛋白和内参大小差不了多少，如果是一块胶的话，剪膜也不能剪。
谢谢大家！这个很容易做，跑两个膜，每张膜上分别Blot两个目的基因，只要保证两个膜使用的都是同样来源的样品就好。
然后在分别strip掉blot内参基因。
如果你非要在一张膜上做的话，取决于你的前两个目的基因使用多抗还是单抗，使用抗兔的二抗的话，你可以先加一个基因的一抗，再加另一个基因的一抗，然后用抗兔的二抗一次将两个基因同时Blot出来。
一般内参基因都是单抗，所以将blot过的膜很轻微的strip一下，去除掉抗兔的二抗即可进一步blot内参，这样两个的结果都没有互相的干扰。
但是你一定要记得，不管你怎么做，内参一定要最后才能blot，如果你先blot了内参，由于内参蛋白在膜上的量实在太大，导致化学发光很强，你在后来无论如何strip还是blot 你的目的基因，都没办法拿到很好的结果。
1．为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。
常用的几种内参。
3。
不同的情况如何选择不同的内参。
1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。
这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。
这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。
严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法对于WB实验，我真的很有发言权，实验室苦干几年加上毕业后在试剂公司做技术支持好几年，我碰到的正常与非正常的WB实验问题肯定比一般人更多！这里给大家分享我们合作的课题组以及我们自己课题组在做WB实验的时候常见的一些问题以及解决方法！在讲WB之前，大家有兴趣的可以保存下这套课程，这是我自己买过的一套解螺旋实验技术学习的课程，2000分钟的实验讲堂，40个实验技能认证培训，有需要的可以自取，能学到非常多的实验实操知识。
好了，继续我们的主题内容。
Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。
Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。
Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
01样本问题Q：蛋白样本如何准备？A：对于细胞样本，蛋白的提取方法比较简单，只需要将细胞培养基弃掉，然后利用PBS清洗2-3次，随后添加RIPA裂解液进行冰上直接裂解，离心上清即为蛋白；但是对于植物和动物组织而言，需要将组织分解成较小的组织块，液氮研磨，后续利用RIPA裂解液进行冰上裂解，相对于细胞蛋白的提取，多了一步组织样块的处理步骤。
02电泳问题Q1：大小分子蛋白各自的电泳胶浓度如何选择？小提示：1、由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；2、大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；3、由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀；4、推荐浓度梯度预制胶，4-20%高分辨率梯度预制胶，分离分子量范围3.5-200kD，大分子量小分子量兼顾，非常好用幺。
Western免疫印迹常见问题解答赛信通(上海)生物试
Western免疫印迹常见问题解答赛信通（上海）生物试做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。
抗体稀释在含5% 的w/v BSA或者1X TBS, 0.1% Tween-20的脱脂奶粉当中。
注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液与稀释比例。
A．所需溶液与试剂注意：所有溶液用Milli-Q或者相当级别的水配制。
1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS):2. 1X SDS 上样缓冲液：3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。
4. 10X Tris缓冲盐水(TBS):配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。
5. 脱脂牛奶:6. 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。
配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。
7. 洗液:1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
9. 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或者BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。
配20ml时，在18ml水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或者脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。
10. Phototope®-辣根过氧化物酶Western印迹检测体系：12. 印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST推荐使用硝酸纤维素膜。
PVDF也能够用本方法。
B．蛋白印迹样品制备的通用方法如下所述：1. 刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。
2. 吸去培养基。
用PBS清洗一次，吸去洗液。
3. 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl，10cm盘中每盘加500μl)4. 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。
Western Blot 的原理,流程及常见问题分析
Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk Room Temperature 1 h
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步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
12
56mA /膜 1h
转膜后确认
丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。 • 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker • 实时监测
丽春红染色结果
• 分子量参照
• 与目的蛋白同时转秱至印迹膜上，检测 转膜效率。
对转膜后的凝胶进行考染
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步骤五、封 闭
FITC、Cy2、Dylight488 AMCA
近红外线
Cy5
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步骤七、检测方法
化学发光法：
HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
化学显色法：
酶标系统HRP----TMB和DAB 酶标系统AP-----BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker
8
步骤四、转膜
• 膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
• 转膜方法：
半干转、湿转
3
WB实验问题解决方案
抗体浓度太低
1.优化抗体的使用浓度。
二抗种属问题
1.确保二抗能够识别所用的一抗
使用的一抗是天然蛋白免疫制备的
1.天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别变性的蛋白，检查抗体的厂家信息，确保可以用来检测你的目的蛋白。
检测试剂过期
1.确保检测试剂的有效期，设置阳性对照。
空白带
信号太强，底物被消耗
1.降低抗体浓度或者蛋白上样量。
2.跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚蓝会干扰荧光信号。
3.当使用Cy3标记的二抗时，使用Tween-20作为去污剂，TritonX-100会干扰Cy3的荧光信号。
4.洗涤最后一步使用PBS或者TBS去除去污剂。
Multiplex问题
与实验设计相关
1.确保二抗能有效地分开不同种属的一抗。
斑点背景
膜上有灰尘污染/圆珠笔做记号
4.对于单抗或者高度纯化的抗体，封闭液中不含去污剂效果会更好。
5.优化洗涤的次数降低信噪比。
6.如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷酸的缓冲液（如PBS）
过度封闭
1.室温封闭不超过1hr或者低温4度过夜。
曝光时间过短
1.延长曝光时间
抗体结合时间不够或者温度不合适
1.一抗或二抗在室温通常结合1-2小时，时间过短容易导致弱信号
转印buffer中甲醇浓度太低
1.提高甲醇的浓度（15%-20%）
蛋白结合时间不够
1.调低电压，延长转印时间。
分子量大的蛋白转印效率低
甲醇浓度太高
1.降低甲醇浓度至10%（V/V）以下。
蛋白结合时间不够
1.使用湿转代替干转。
2.延长转印时间。
蛋白凝胶浓度太高
1.降低凝胶浓度
WB实验常见问题与解决方案
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过 特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白 质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取 很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 原 理 示 意 图
红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 过 程 示 意 图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置 全细胞
胞浆（可溶性蛋白）
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
Western blot发光检测中常见问题及解决办法
现象
原因
解决办法
信号弱或无
背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。
WB免疫印迹实验常见问题全汇总
【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。
WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。
3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。
4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。
6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
western免疫印迹的注意事项
western免疫印迹实验流程和蛋白条带的注意事项一、条带中所遇到的情况1. 完全没有条带完全没有条带的原因主要有以下4点：（1）抗体加错（最常见一抗加错抗体，或二抗种属加错）。
（2）转膜出现了问题（常见膜放反）。
（3）发光液失效或不够灵敏。
（4）蛋白上样量过少，一抗浓度太低2. 目的条带有但高背景高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景，主要原因：（1）洗膜时间和次数不够（常用10min*3）。
（2）封闭不够好。
（3）一抗浓度过高，可通过调整一抗浓度来降低背景。
3.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过，在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。
注意与高背景区别。
4.背景出现黑点由于封闭时牛奶不纯，没有完全溶解致使颗粒残留，同时封闭后清洗不完全，也会导致背景出现黑色斑点。
5.条带上有白色小点由于电转中膜和胶之间存在气泡，转膜时一定要将气泡都去除。
6.非特异性条带主要由于一抗非特异性与蛋白结合，建议更换抗体。
7.条带拖尾主要原因：（1）蛋白量太大。
（2）一抗浓度过大，孵育时间太长。
8.条带呈哑铃状（1）胶在配置过程中未冷却完全，胶不够均一。
（2）样品中含有太多杂质，没有离心下来，杂质沉积在孔的中间。
9.电泳中出现问题（1）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳时电压过大发热，应该降低电压或者冰浴。
（2）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。
二、内参的选择1. Actin，Tubulin，GAPDH都为最常用的内参抗体，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，GAPDH与前两者相比比较稳定，建议选择。
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。
其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。
众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。
拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。
在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。
ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。
图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。
现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。
在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。
首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。
WB 过程中常见问题1
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
WB 实验中常会出现各种问题问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议4℃ 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。
洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
【2017年整理】WesternBlot常见问题及处理
Western Blot常见问题及处理Western印迹要想做的好，每个步骤都不能马虎，细节决定成败！做的过程中自己要多总结，用心去体会，失败不可怕，可怕的是不去总结经验和教训，成功都是从不断的失败中得来的。
注意事项：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.加水液封时用100ul的枪,缓慢均匀的加,以免产生胶不均匀.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min) .加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对pvdf膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.否则一旦弄错先后顺序会很麻烦的。
转膜前1-2个小时-20°预冷转膜液，特别是新鲜配的转膜液。
预冷后转膜效果较好。
转膜液可以重复利用，每次用的时候再加点甲醇就可以了。
转膜时，一定要将三明治各层之间的气泡赶干净，否则转膜时产热量会很大，很影响转膜效率。
离心管装满水放-20°冻好，放在转膜液中降温。
转膜完，可以通过预染marker看看转膜的情况。
有没有转过了穿到膜后的滤纸上，或者还有部分残留在胶上。
以便下次调整转膜时间和电压。
二抗浓度不宜太高否则会导致背景过高.常见问题：1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。
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【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦
做了很久的WB（western blot ），走了很多弯路，但是WE想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。
WB常见问题分析
1. 为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
原因有很多：
a）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
b）细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；
c）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
d）酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2. 我做的蛋白质分子量很小（10KDa ），请问怎么做 WB ？
a）可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可；
b）也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用
Tricin e-SDS-PAGE 体系。
3. 我的目的带很弱，如何加强？
a）可以加大抗原上样量，这是最主要的；
b）也可以将一抗稀释比例降低；
c）还可以延长曝光时间。
4. DAB好还是ECL好？
DAB有毒，但是比较灵敏，是 HRP最敏感的底物；
ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以
检测pg级抗原。
5. 胶片是一片空白，是怎么回事？
如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a）二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；
b）ECM 底物中H2O2，不稳定，失活；
c）ECL底物没覆盖到相应位置；
d）一抗选择不当二抗失活；
e）二抗失活。
6. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7. 细胞水平要做 WB，多少细胞提的蛋白够做 WB ?
一般5X106就足够。
8. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30 % 是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
9. 大分子量蛋白200KDa，在做 WB要注意什么？
a）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择 >7%的；剥胶时要小心；
b）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
c）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦！
10. 免疫组化和 WB可以用同一种抗体吗？
免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB ,而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
11. WB中抗体的可以重复应用吗？
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。
稀释后应在2- 3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
12. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？
无特殊要求。
但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
WB实验中常会出现各种问题，也跟技术菌们一起分享下WB实验中各种问题及
应用对策，希望给您的实验带来实实在在的帮助~
WB可题汇总及解决建议
问题原因解决方案
胶凝的不均匀，聚合不好灌胶前将溶液充分混匀
某些样品盐浓度较高除盐或将样品盐浓度调成一致
条带形状不1
缓冲液陈旧，成分改变重配
好看
凝胶下面有气泡电泳前先将气泡赶走
电泳时温度过高降低电流或电压
样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀
电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样
样品上样量不足或目的蛋白浓
度过低
加大上样量或浓缩样品
转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流
蛋白条带信
抗体浓度低增加抗体浓度或延长孵育时间
号弱
封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间，换用不冋封
闭剂类型
显色剂失效
更换显色剂（吸取A、B液的枪头不可混
用）
显色或曝光时间不足延长显色或曝光时间
HRP抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
转膜缓冲液pH值与目的蛋白等
电点相近
提高转膜缓冲液pH值
凝胶与膜之间存在气泡转膜前要排尽气泡
转印膜种类选择不当
使用质量可靠的 PVDF膜或硝酸纤
维素膜
转膜效率
低电压或电流过小
湿转时20mA恒流，半干转时25V 左右恒
压
转印时间过长或过短
根据蛋白大小及转印装置选择合适
的转印时间
湿转过程中环境温度过高使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度
显色或曝光后无条带选用的一抗、二抗及显色方法不
合适
选择合适的一抗、二抗和显色方法
目的蛋白含量低于检测下限加大上样量或浓缩样品
抗体效价过低增加抗体浓度
抗体孵育时间不足
延长孵育时间，37。
C孵育1小时以
上
抗体过度洗涤
减少洗涤时间及次数，加入的去垢剂不宜
过强或过多
加入HRP底物反应与曝光检测
之间间隔时间过长
反应3到5分钟及时检测
膜没有完全均匀湿透使用100% methanol浸透膜
洗膜不充分增加洗液体积和洗涤次数
封闭物用量不足
提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全
浸没转印膜
封闭物使用不当
检测生物素标记的蛋白时不可用脱
脂奶粉圭寸闭
背景高］封闭时间不够
室温37度封闭1小时以上，4度封闭过
夜
抗体非特异性结合降低抗体浓度，减少孵育时间
一抗稀释度不适宜
对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体
稀释度
一抗孵育的温度偏咼建议4C结合过夜
抗体浓度过高或洗涤不够降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间
化学显色底物过多按说明书加入适量的显色底物
蛋白条带位相对电荷氨基酸电荷的组成置
（大小）胶浓度不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可
能有所偏差，调整浓度
不对抗体孵育不充分增加抗体浓度，延长孵育时间
酶失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。
选择在有效期内、有活性的酶联物
目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体查询相关文献确定
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太
低
设置阳性对照比对结果，增加标本上样量
目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小
样本处理过程中目的蛋白发生降解
加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操
作
杂蛋白多处理目的蛋白
杂带多
抗体特异性不强使用特异性强的抗体
抗体孵育时间过久减少抗体孵育时间
一抗与抗原有交叉反应选择合适的圭寸闭物
—聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度
底物显色与曝光时间过长缩短显色及曝光的时间
膜孔径太小更换孔径较大的膜
转膜电压电流低提高电压/电流
大分子量
WB
转膜时间短延长转膜时间
胶浓度太大使用低浓度的胶
转膜缓冲液配方不合适调整转膜缓冲液中甲醇及 SDS浓度
背景有黑色抗体与封闭试剂反应使用前过滤封闭试剂
斑点HRP偶联二抗中有聚集体过滤二抗试剂，去除聚集体
120K&—
►
120KD-+ 12COT 9CKD~>
9OKD —►
9OKD-* 50KD T
5OKD —►
5OKD->
35KD —
35KD-* 35K&->
25KD —►
25KDT 沥KD —
2DKDf
20KD —►
2OKD->
lXkDa 一
130KDL 95kDL T2kD —
S5kDa — bOhDa —
36kDa^
35kDa — 25kDa —
17kDa — 30kDa^
17kE>ti —
10kt>i —
暗背景上白
色带
HRP 含量过高
降低酶联二抗的浓度
背景有不均 匀的白色斑 占 八、、
抗体分布不均匀
孵育抗体时使用摇床
顺便给大家来几张在实验中的
10kDa —
Uns 1 Lms 2
Lane 1 Lane 2Lane 3
LWl Lim ? Une3L»l LJH«5
25<*D L
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55kl>*—。