WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦

做了很久的WB（western blot ），走了很多弯路，但是WE想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。

以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。

WB常见问题分析

1. 为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？

原因有很多：

a）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；

b）细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；

c）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；

d）酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。

2. 我做的蛋白质分子量很小（10KDa ），请问怎么做 WB ？

a）可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可；

b）也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用

Tricin e-SDS-PAGE 体系。

3. 我的目的带很弱，如何加强？

a）可以加大抗原上样量，这是最主要的；

b）也可以将一抗稀释比例降低；

c）还可以延长曝光时间。

4. DAB好还是ECL好？

DAB有毒，但是比较灵敏，是 HRP最敏感的底物；

ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以

检测pg级抗原。

5. 胶片是一片空白，是怎么回事？

如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a）二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；

b）ECM 底物中H2O2，不稳定，失活；

c）ECL底物没覆盖到相应位置；

d）一抗选择不当二抗失活；

e）二抗失活。

6. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

7. 细胞水平要做 WB，多少细胞提的蛋白够做 WB ?

一般5X106就足够。

8. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30 % 是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

9. 大分子量蛋白200KDa，在做 WB要注意什么？

a）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择 >7%的；剥胶时要小心；

b）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

c）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦！

10. 免疫组化和 WB可以用同一种抗体吗？

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB ,而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

11. WB中抗体的可以重复应用吗？

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。

稀释后应在2- 3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

12. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？

无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

WB实验中常会出现各种问题，也跟技术菌们一起分享下WB实验中各种问题及

应用对策，希望给您的实验带来实实在在的帮助~

WB可题汇总及解决建议

问题原因解决方案

胶凝的不均匀，聚合不好灌胶前将溶液充分混匀

某些样品盐浓度较高除盐或将样品盐浓度调成一致

条带形状不1

缓冲液陈旧，成分改变重配

好看

凝胶下面有气泡电泳前先将气泡赶走

电泳时温度过高降低电流或电压

样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀

电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样

样品上样量不足或目的蛋白浓

度过低

加大上样量或浓缩样品

转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流

蛋白条带信

抗体浓度低增加抗体浓度或延长孵育时间

号弱

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间，换用不冋封

闭剂类型

显色剂失效

更换显色剂（吸取A、B液的枪头不可混

用）

显色或曝光时间不足延长显色或曝光时间

HRP抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

转膜缓冲液pH值与目的蛋白等

电点相近

提高转膜缓冲液pH值

凝胶与膜之间存在气泡转膜前要排尽气泡

转印膜种类选择不当

使用质量可靠的 PVDF膜或硝酸纤

维素膜

转膜效率

低电压或电流过小

湿转时20mA恒流，半干转时25V 左右恒

压

转印时间过长或过短

根据蛋白大小及转印装置选择合适

的转印时间

湿转过程中环境温度过高使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度

显色或曝光后无条带选用的一抗、二抗及显色方法不

合适

选择合适的一抗、二抗和显色方法