蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答
western常见问题及解决方法
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电泳
• 问题四：电泳时上样量应为多少？
这个没有确切的定值，一般来说20微克 就可以，但是如果你的样品中目的蛋白 含量很少，可以加大上样量到60微克甚 至更高（进行预实验）
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实验流程
蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 √ 电转 封闭及一抗 显色
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电转
• 问题一.电转选择什么样的膜最好？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适 合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比 较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢 固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重 复使用。
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细胞和组织的处理
• 问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适？ 解答：温度越低越好 1、液氮 2、-80度冰箱 3、-30度冰箱 4、加入loading buffer煮后保存于-20度。
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实验流程
蛋白提取 √ SDS凝胶配制
电泳 电转 封闭及一抗 显色
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SDS凝胶配制
• 问题一.胶凝的效果不好是什么原因？ 1、AP时间过长，重新配制AP 2、可以适当多加入TEMED 3、室温低 4、混合不均匀
Western blot 实验技术 ——常见问题及解决方法
• Western实验是一 项连贯的有多个步 骤的实验技术，在 实验过程中会遇到 很多的问题，每一 个环节出现问题都 可能导致最后结果 的失败。
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实验流程
√ 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色
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蛋白提取
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、 溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂
不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀 浆器和液氮研磨 2、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等， 使用上述织的处理
• 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 • 研磨的时候不充分，会形成絮状的液态
SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法
SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法SDS,PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS,PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论: Q:SDS,PAGE电泳的基本原理,A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:logMW=K-bX，式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响,A:在SDS,PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris,HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris,甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
（完整版）westernblot问题汇总
（完整版）westernblot问题汇总WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。
按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。
我在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高！1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制。
通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
Westernblot实验注意事项和常见问题
Westernblot实验注意事项和常见问题1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3最后显色时用 DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？答：一般5×106就足够了。
6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？答：能，没有问题。
7同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
8 蛋白变性后可以存放多久？答：－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。
Western Blotting 各种问题及解决办法
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存 在
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高 抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间 确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 每一步孵育都应确保充分 重新配制缓冲液 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时，应避免相互堆叠 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 使用新的缓冲液 用前过滤 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润
western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版
6 反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
A液
B液
ECL工作 混合 液
暗室操作！
1
:
1
膜
在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的 底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的 产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物， 将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯 萘酚氧化成蓝色产物。
膜的选择：
最常用于Western Blot的转移膜主要是 硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚 偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维 素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似, 主要用于核酸杂交。
几种膜的对比
3
目的蛋白 与其它蛋白 的互作
2
目的蛋 白的表达 量分析
4
二 Western Blot技术流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜
•封闭
•一抗杂交
•二抗杂交 •底物显色
1.蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白
质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性
一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡 1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况 调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比 脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗 体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背 景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合 的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。
western-blot过程中常见问题及解决对策
解决对策
两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平
玻璃没有洗干净，应该洗得很干净
过硫酸铵和TEMED加量相对较多
加完试剂后应摇匀
总是漏胶
避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损
将两块玻璃板摆放对齐，底部处于同一平面
膜上有明显气泡
操作时将气泡完全排除
靠膜一侧的滤纸应铺平
特异性低
优化一抗
提高一抗和二抗的稀释度
降低SDS-PAGE中蛋白的上样量
背景高优化封闭液ຫໍສະໝຸດ 优化洗涤缓冲液，增加洗涤次数
减少曝光时间
信号低
优化一抗
浓缩样品
选择更高灵敏度的发光液，如enlight等。
SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法
SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法SDS,PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS,PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论: Q:SDS,PAGE电泳的基本原理,A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:logMW=K-bX，式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响,A:在SDS,PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris,HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris,甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
Western blot常见14个问题解决
Western blot常见问题解决1. 啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，可能一抗，二抗加错，可能是蛋白浓度太低，上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2. 高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来8min*5次或者10min*4次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
3. 非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗或降低一抗浓度经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下也有可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
4. 条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。
注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）1. Western blot结果中的背景为什么较高?可能的原因及建议1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
7.一抗不纯——纯化抗体8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
westernblot实验步骤中常见问题和处理方法
westernblot实验步骤中常见问题和处理方法Western blot 结果中背景较高 (high background):膜封闭不够/封闭液（blocking buffer）不适合：延长封闭时间，增加封闭液的浓度；尝试不同种类的封闭液，对比结果后选出效果最佳的。
洗膜不够彻底：增长洗涤时间；增加洗涤剂的浓度。
一抗/二抗(primary/secondary antibodies) 稀释度不适宜：对抗体进行滴度测试（titre test），选择最适宜的抗体稀释度。
一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。
膜在实验过程中干过: 实验过程中要切记保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长: 减少曝光时间。
Western blot 结果中杂带较多 (multiple/non-specific bands):目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点（phosphorylation site）、糖基化位点(glycosylation site)、乙酰化位点(acetylation site) 等），本身可以呈现多条带。
样本处理过程中目的蛋白发生降解(protein degradation): 加入蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor)；样本处理时在冰上操作; 避免/减少样本的冻融循环（free-and-thaw cycle）。
样本处理过程中目的蛋白发生聚集（protein aggregation）：增加DTT的浓度；增长加热的时间。
上样量（sample loading）/ 样本浓度过高：适当减少上样量/样本浓度。
一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。
一抗/二抗不纯：纯化抗体；购买高纯度抗体。
western常见问题及解决方法
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细胞和组织的处理
• 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 • 研磨的时候不充分，会形成絮状的液态
物质，如有手动匀浆器可以再进行处理
注意：
• 裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般 的蛋白加入PMSF即可，个别蛋白需要 加Aprotinin， Leupeptin ，做磷酸化 的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂 （cocktail）
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电转
• 膜的选择还要考虑到目的蛋白分子 量的大小，如果目的蛋白分子量为 20KD以下，最好用0.22微米的膜， 大于20KD可以选择0.45微米的膜。
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电转
• 问题二.电转时膜、滤纸、胶大小有何讲究？
如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸 －》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶 小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。
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细胞和组织的处理
• 问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适？ 解答：温度越低越好 1、液氮 2、-80度冰箱 3、-30度冰箱 4、加入loading buffer煮后保存于-20度。
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实验流程
蛋白提取 √ SDS凝胶配制
电泳 电转 封闭及一抗 显色
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SDS凝胶配制
• 问题一.胶凝的效果不好是什么原因？ 1、AP时间过长，重新配制AP 2、可以适当多加入TEMED 3、室温低 4、混合不均匀
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电泳
• 问题二.跑电泳的时候配的胶总是“缩” 是什么原因呢？是有的成分不对吗？ 胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜 包起来，在里面加点水保持湿度就可以 了。 也可能母液（30%聚丙烯酰胺）有问题， 你可以重新配制一份观察
Western blotting 常见问题分析
Western blotting 常见问题分析SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析Western Blotting实验流程第一步：蛋白样品制备蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。
作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。
RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。
第二步：蛋白定量为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。
蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。
如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。
第三步：电泳(1) SDS-PAGE凝胶配制沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）；PMSF(100mM)（WB0016）；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。
(2) 样品处理每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。
置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。
(3) 上样与电泳第四步：转膜转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。
western-blot常见问题及解答
常见问题及解答：1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平1) 你的玻璃洗干净没有应该要洗得非常干净！2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平；4) 稍微注意手法，均匀加入5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用20%的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡，使用效果极好）。
战友小新723认为：“第一天灌胶后，用乙醇直接压，待乙醇挥发完毕后，上面加一层水，第二天电泳用，效果很好。
不用正丁醇，乙醇比正丁醇效果要好多了”。
6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，造成胶聚合不均匀。
【2、胶为什么总是漏1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。
western blot电泳时浓缩胶漏样解决方法
一、胶漏样的产生原因1.1 电泳胶溶液不均匀在进行western blot电泳时，如果电泳胶溶液不均匀，可能导致胶漏样的产生。
这可能是由于配制电泳胶时均匀性不够，或者在注入电泳胶溶液到凝胶板中时出现了区域性的浓度不匀。
1.2 电泳胶板密封不严另外，如果电泳胶板的密封不严，也有可能导致胶漏样的出现。
在进行电泳前，应该确保电泳胶板的密封性良好，避免溶液外溢造成胶漏。
1.3 蛋白质样品过量过量的蛋白质样品也是造成胶漏样的原因之一。
当加载样品时，应该控制好加载量，避免样品过量导致胶漏。
二、解决方法2.1 水平电泳胶漏样的解决方法对于水平电泳胶漏样，可以采取以下解决方法：a）增加胶液流速：可以通过增加电场强度或者减少电泳时间来提高胶液的流速，从而减少胶漏样的产生。
b）检查电泳槽的密封性：确保电泳槽的密封性良好，以防止胶液外溢。
c）调整加载样品量：控制好加载样品的量，避免过量加载造成胶漏。
2.2 垂直电泳胶漏样的解决方法对于垂直电泳胶漏样，可以采取以下解决方法：a）增加电泳胶凝胶浓度：通过增加凝胶浓度来提高凝胶的网状结构，减少胶漏样的产生。
b）减少电场强度：适当减少电场强度，以降低电泳胶的流速，减少胶漏样的发生。
c）优化加载样品的方式：确保样品加载均匀，并且控制好加载量，避免过量加载导致胶漏。
2.3 其他常见的解决方法还可以采取以下方法来解决胶漏样的问题：a）增加文献资料的参考：查阅相关文献，了解其他研究者在解决胶漏样问题上的经验，寻找更多的解决思路。
b）请教专家意见：在遇到较为棘手的胶漏样问题时，可以向相关专家请教，寻求专业的建议和指导。
三、结语在进行western blot电泳时，胶漏样的产生可能会对实验结果造成影响，因此需要及时解决。
通过合理的操作和解决方法，可以有效减少胶漏样的发生，提高western blot实验的成功率和准确性。
希望本文介绍的解决方法能对您在实验中遇到的胶漏样问题有所帮助。
当进行western blot电泳实验时，胶漏样的产生可能会给实验结果带来一定的干扰，因此在实验过程中需要特别注意操作的细节和条件的控制，以尽量避免胶漏样的产生。
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蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C 保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%(w/v)过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
PH8.39、1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
10S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S 使用液。
使用后应予以废弃。
1112、13、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
14、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
15、过氧化物酶标记的第二抗体。
16、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
17、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
18、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
19、 100mmol/L NaCl。
20、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（4）主要程序这主要列举了一些网站上有关Western Blot的英文资料，读者可以根据自己实验室的实际情况进行调整：Western Blot PROTOCOL：1、Preparation of Brain Membrane Fractions for Western Blot2、Western Blotting3、Western Blots4、Western Blotting5、General Western Blot Protocol 6 、Western Blot & Immunostaining7、Western Blot Analysis for Tissue8 Western Blotting9、ECM Protocols Western Blot 10、Western Blotting Using Chemilμminscence11、Far Western Blotting12、Enzyme-Assisted Immunoelectroblotitng13、Western Trouble Shooting 14、Too Many Bands on Western BlotTips and hints for the storage of antibodies（5）实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南 a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：12Western Blot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？解答：一般地5* 106就足够了。
Western Blot有无影响?解答：能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F.解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％， Stacking Gel 3.5％。
I.解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。
J. 蛋白变性后可以存放多久？解答：－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktailO. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。