Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究westernblot

WesternBlot常见问题及处理总结

阿木

1、westernblot的优点

答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg级。方便，特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

答：原因有很多:a)你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c)你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长，b)也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？

答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱，怎么加强？

答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏，有什么解决方法？

答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a)二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；b)ECM 底物中H2O2，不稳定，失活；c)ECL底物没覆盖到相应位置；d)二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；

b)显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好？

答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。要看你实验的情况。

11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等

12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？

答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够，。

13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和westernblot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

15、做WesternBlot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

16、细胞水平要做westernblot，多少细胞提的蛋白够做westernblot？

答：一般5×10^6就足够了

17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对westernblot有无影响？

答：能，没有问题。

18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？

答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作

需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？

答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶3.5％。

22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试

1.5mm的。

23、蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

答：WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开