Western Blot常见问题解析
WesternBlot常见问题及处理
WesternBlot常见问题及处理1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多：a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长， b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
Western Blotting 各种问题及解决办法
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存 在
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高 抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间 确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 每一步孵育都应确保充分 重新配制缓冲液 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时，应避免相互堆叠 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 使用新的缓冲液 用前过滤 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润
Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)
⑷设置二抗对照(不加一抗),降低二抗
浓度
⑸一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
⑸在孵育和洗涤液中加入Tween-20
以减少交叉反应.
⑹洗膜不充分
⑹增加洗涤次数及时间
⑺膜不合适
⑺NC 膜比 PVDF 膜背景低
⑻膜干燥
⑻保证充分反应液，避免出现干膜现象
⑼显色时间过长
⑼缩短显色时间
⑽膜没有均匀浸湿
⑽转膜前用 100%甲醇将膜完全浸湿
（无关蛋白中含有与待测抗原结构类似多肽（共 或更换封闭剂（脱脂奶、BSA或明胶）
同抗原表位），与特异抗体发生交叉反应）
⑷一抗不识别目的物种的靶蛋白
⑷检查说明书，或做 ClustalW 比对，
设阳性对照
⑸样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低
⑸模索条件，设置阳性对照，增加标本
（抗原无效）
上样量，样本制备时使用蛋白酶抑制剂,
或分级提取目的蛋白。
⑹转膜不充分,或洗膜过度
⑹使用丽春红 S 检膜。
⑺过度封闭
⑺使用含 0.5%脱脂奶或无脱脂奶抗体
稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间。
⑻一抗失效
⑻使用有效期内抗体,分装保存,避免反
复冻融取用, 工作液现配现用
⑼二抗受叠氮钠抑制
⑼溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP
Western blot 结果异常原因分析及对策（个人总结）
结果异常
原因
对策
1.假阴性，不出现 ⑴一抗、二抗等不匹配
⑴重新订购试剂，认真选取一抗与组织
蛋白条带或者蛋
种属，并设置内参。
白条带很弱
⑵一抗或/和二抗浓度低
⑵增加抗体浓度，延长孵育时间
⑶封闭剂或无关蛋白与一抗或二抗有交叉反应 ⑶封闭用温和去污剂，如TWEEN 20，
WB中常见问题和解决方法（学术论文）
1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4.Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
WesternBlot详解及常见问题
Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下W e stern Blot技术。
Conten ts：（1）原理（2）分类i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光EC Fiv. 底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南1. 参考书推荐2. 针对样品的常见问题3. 抗体4. 滤纸、胶和膜的问题5. Marker的相关疑问6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理与South ern或N o rthe rn杂交方法类似，但Weste rn Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类wester n显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光EC Fiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
Western blot常见14个问题解决
Western blot常见问题解决1. 啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，可能一抗，二抗加错，可能是蛋白浓度太低，上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2. 高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来8min*5次或者10min*4次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
3. 非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗或降低一抗浓度经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下也有可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
4. 条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。
注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
Western Blot 常见问题分析
Western Blot 常见问题分析8 t W5 _0 U6 |: U, ]$ b; d) O1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下二者在使用中的区别？; e2 Q8 R, H& o! @1 A4 u: @选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。
PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。
但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。
: Y0 g" l9 S) O' p8 uwestern blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
6 p) e4 c- U: n/ i/ E; |2. 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？1 r' @. k n/ J不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
# Y8 y5 S% t, g4 d6 ^+ w3. 做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？; u5 D* p- |: O0 ?9 D最好还是不要同时加两种一抗。
因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。
做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。
+ B% W1 U3 c' C2 O; O4. western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？" m) ~/ c) t4 `! h4 ]* W5 HPVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
westernblot实验步骤中常见问题和处理方法
westernblot实验步骤中常见问题和处理方法Western blot 结果中背景较高 (high background):膜封闭不够/封闭液（blocking buffer）不适合：延长封闭时间，增加封闭液的浓度；尝试不同种类的封闭液，对比结果后选出效果最佳的。
洗膜不够彻底：增长洗涤时间；增加洗涤剂的浓度。
一抗/二抗(primary/secondary antibodies) 稀释度不适宜：对抗体进行滴度测试（titre test），选择最适宜的抗体稀释度。
一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。
膜在实验过程中干过: 实验过程中要切记保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长: 减少曝光时间。
Western blot 结果中杂带较多 (multiple/non-specific bands):目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点（phosphorylation site）、糖基化位点(glycosylation site)、乙酰化位点(acetylation site) 等），本身可以呈现多条带。
样本处理过程中目的蛋白发生降解(protein degradation): 加入蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor)；样本处理时在冰上操作; 避免/减少样本的冻融循环（free-and-thaw cycle）。
样本处理过程中目的蛋白发生聚集（protein aggregation）：增加DTT的浓度；增长加热的时间。
上样量（sample loading）/ 样本浓度过高：适当减少上样量/样本浓度。
一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低，可能与其他蛋白结合，建议换用单克隆抗体（monoclonal antibody）。
一抗/二抗不纯：纯化抗体；购买高纯度抗体。
WesternBlot实验常见问题罗列
WesternBlot实验常见问题罗列1. 一抗，二抗的比例怎么样？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，去掉部分非特异的本底。
2. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，根据实验条件来选择，一般选HRP标记的二抗。
3. 公司内的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。
我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。
至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。
一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。
另外建议你洗膜时，多洗几次，好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！4. **组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：**组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于**组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于**组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）5. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。
Western blotting 常见问题分析
Western blotting 常见问题分析SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析Western Blotting实验流程第一步：蛋白样品制备蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。
作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。
RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。
第二步：蛋白定量为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。
蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。
如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。
第三步：电泳(1) SDS-PAGE凝胶配制沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）；PMSF(100mM)（WB0016）；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。
(2) 样品处理每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。
置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。
(3) 上样与电泳第四步：转膜转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。
western-blot常见问题及解答
常见问题及解答：1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平1) 你的玻璃洗干净没有应该要洗得非常干净！2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平；4) 稍微注意手法，均匀加入5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用20%的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡，使用效果极好）。
战友小新723认为：“第一天灌胶后，用乙醇直接压，待乙醇挥发完毕后，上面加一层水，第二天电泳用，效果很好。
不用正丁醇，乙醇比正丁醇效果要好多了”。
6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，造成胶聚合不均匀。
【2、胶为什么总是漏1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。
新手上路Westernblot问题集合
新手上路Western blot问题集合对于一个新手，试验中会遇到很多问题，我总结了一下常见问题，希望对您有所帮助。
Q1: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？A1:一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，若反复洗几次后，蛋白容易掉下来，效果较差。
尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。
这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，效果较好。
Q2:做组织样品的western blot的时候，处理样品有什么诀窍？A2: 必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂），封闭剂一般5%脱脂奶粉。
如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择Q3:免疫组化和Western blot可以用同一种抗体吗？A3: 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western blotting，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）Q4: 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？A4: 可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。
western blot常见问题解答
根据笔者多年实际操作经验，介绍了wb实验概念和步骤，最后归纳总结了wb 实验常见问题以及解决方法，希望对您的科研提供一些帮助。
1. 什么是western blot?答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。
2. western blot 有什么优点？答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
3. western blot 的具体步骤是什么？一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），1）组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。
2）加入5×STOP buffer3）180W, 6mins，0℃超声波破碎4）5000rpm，5mins 离心，取上清。
5）加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）6）煮沸，10min7）分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
二．电泳（SDS-PAGE）建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5 ％胶。
1）配胶（one piece）A.分离胶。
单位：ml。
Total: 8ml 7.5％10％15%2×Sep. buffer 4 4 430％Gel.sol 2.0 2.7 4ddH2O 1.9 1.2 0TEMED 8ul 8ul 8ul10%APS 80ul 80ul 80ulB. 浓缩胶。
单位：ml。
Total: 3.5ml 3％2×Stacking. buffer 1.730％Gel.sol 0.35ddH2O 1.4TEMED 5ul10%APS 50ul2)点样。
上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，3）电泳。
开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。