免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤
WB技术
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
Co-IP实验步骤
免疫共沉淀实验步骤：1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。
2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。
（阴性对照组为相同的种属的抗体）3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。
用IP buffer洗涤3次，每次4℃12000rpm离心5min，弃上清。
加入40μl 2×上样缓冲液。
沸水中煮10 min变性蛋白。
取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。
IP buffer20mM Tric-Hcl137mM NaCl10% Glycerol1% Np-401mM EDTA注意事项：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。
(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
（8）如何选择prorein A/G 树脂见abcam IP 实验步骤。
免疫共沉淀Co-IP实验步骤
免疫共沉淀Co-IP实验步骤Co-IP实验步骤一、制备细胞样品1.10cm盘细胞用PBS清洗两次，加入1mL RIPA裂解液和10μL PMSF（100mM稀释至1mM）；2.充分混匀吹打后，冰上裂解4h，充分吹打吸入1.5mL EP管中，-80℃保存；3.取出样品，1200rpm离心10min，取上清弃沉淀，测定蛋白浓度。
二、Co-IP，拉出蛋白1.每管取出少量蛋白样（15~30μL）作为input；2.将磁珠充分混匀后，取出50μL于1.5mL EP管中，置于磁力架上，弃上清。
（有几个样品就准备几管）；3.加入200μL Ab binding&washing Buffer（可用PBST代替），加入对应抗体，加入后轻弹混匀，360°混合仪上旋转30min；4.500rpm离心使管壁液体下来，弃上清，200μL PBS清洗（旋转5min）；5.加入1000μg 蛋白样品于EP管中，轻弹混匀，旋转1h，弃上清；6.加入200μL was hing buffer（或PBST）清洗3次；7.加入100μL washing buffer 悬浮磁珠并将溶液转移至新的EP 管中；8.弃上清，加入6μL 5×loading buffer，24μL Elution buffer （或ddw，洗脱液）；9.100℃煮10min，吸取上清；10.进行WB或SDS-PAGE。
注意事项：1.标记：样品名+抗体名；2.抗体上必须标有“IP”字样，有推荐用量；3.Co-IP中pull down 抗体与WB抗体的来源（M,R）必须不同；4.PBST=PBS + 0.02% 吐温。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。
免疫共沉淀Co-IP实验步骤
Co-IP实验步骤
一、制备细胞样品
1.10cm盘细胞用PBS清洗两次，加入1mL RIPA裂解液和10μL PMSF
（100mM稀释至1mM）；
2.充分混匀吹打后，冰上裂解4h，充分吹打吸入1.5mL EP管中，
-80℃保存；
3.取出样品，1200rpm离心10min，取上清弃沉淀，测定蛋白浓度。
二、Co-IP，拉出蛋白
1.每管取出少量蛋白样（15~30μL）作为input；
2.将磁珠充分混匀后，取出50μL于1.5mL EP管中，置于磁力架上，
弃上清。
（有几个样品就准备几管）；
3.加入200μL Ab binding&washing Buffer（可用PBST代替），加入对
应抗体，加入后轻弹混匀，360°混合仪上旋转30min；
4.500rpm离心使管壁液体下来，弃上清，200μL PBS清洗（旋转
5min）；
5.加入1000μg 蛋白样品于EP管中，轻弹混匀，旋转1h，弃上清；
6.加入200μL washing buffer（或PBST）清洗3次；
7.加入100μL washing buffer 悬浮磁珠并将溶液转移至新的EP管中；
8.弃上清，加入6μL 5×loading buffer，24μL Elution buffer（或ddw，
洗脱液）；
9.100℃煮10min，吸取上清；
10.进行WB或SDS-PAGE。
注意事项：
1.标记：样品名+抗体名；
2.抗体上必须标有“IP”字样，有推荐用量；
3.Co-IP中pull down 抗体与WB抗体的来源（M,R）必须不同；
4.PBST=PBS + 0.02% 吐温。
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose 的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP )protocal 操作流程
Co-IP ProtocolOverview:Day1 45min1.复苏2.铺板（晚上）Day2 40min3.转染（上午）4.换液（6小时候）Day4 1h5.48hr收细胞6.Co-IP(day1)到加抗体O/N7.Co-IP(day2) Day5 3-4h8.WB(day1)至一抗孵育Day5 or Day6 all day9.WB(day2),显影Day6 3-4hProcedures:1.Co-transfect myc-A and HA-B in 6 wells；2.Aspirate the medium and wash with PBS once (Careful not to the shake the cells off)；3.Harvest cells on ice with PBS+1%triton+Protease Inhibitor(100x) 300µl per well；4.Move liquid to 1.5ml EP tube；5.ice bath，Sonicate 8 strokes， 3-4 times every tube，open 2 secs，stop 2 secs；6.Rotate in cold room rotor for 20min；7.Centrifuge at max speed 20min, at 4°C；8.Collect supernatant. Get OFFER ( get 56 µl，add 14 µl 5xLoading Dye )。
OPTIONAL: PRECLEAR9.Pre-clear 150 µl supernatant with 60 µl protein-G beads for 1hr in cold room rotor.10.Centrifuge at 5000 rpm for 1 min at 4°C.11.Transfer the supernatant to a new tube.12.Add 2 µl of myc-Ab to IP；adding PBS to 800µl；13.Incubate O/N in cold room rotor；14.Add 60~100 µl of Protein-G beads；15.Incubate 2hrs in cold room rotor；16.Centrifuge 5,000rpm for 15min at 4°C；17.Wash with PBS + 1% triton for 4 times，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for2-5min at 4°C；18.Wash three times with PBS，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for 2-5min at4°C；19.Elude protein with 65 µl of 5x SDS loading buffer；20.Boil for 5 mins；21.Load 20 µl per hole to run western-blot for myc, HA and stim1。
[重点]Co-IP实验步骤
![[重点]Co-IP实验步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/9ca27414bb1aa8114431b90d6c85ec3a87c28bc1.png)
免疫共沉淀实验步骤：1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。
2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。
（阴性对照组为相同的种属的抗体）3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。
用IP buffer洗涤3次，每次4℃12000rpm离心5min，弃上清。
加入40μl 2×上样缓冲液。
沸水中煮10 min变性蛋白。
取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。
IP buffer20mM Tric-Hcl137mM NaCl10% Glycerol1% Np-401mM EDTA注意事项：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Trito n X-100)。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。
(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
IP与CO-IP实验步骤指南：从样本处理到相互作用分析
IP与CO-IP实验步骤指南：从样本处理到相互作用分析生物药物研究中，了解蛋白质之间的相互作用对于理解细胞信号传导、疾病机制以及药物研发具有重要意义。
免疫沉淀（Immunoprecipitation，简称IP）和共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation，简称CO-IP）是常用的实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用关系。
本文将从样本处理到相互作用分析，为您详细介绍IP与CO-IP实验的步骤与原理。
1. 样本处理在进行IP与CO-IP实验之前，样本的处理是非常重要的。
样本可以是细胞提取物或组织提取物。
以下是样本处理的步骤：1.1 细胞培养与收集。
首先，将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到合适的生长状态。
然后，使用适当的方法（如洗涤、剥离或裂解）收集细胞。
1.2 细胞裂解。
将收集到的细胞进行裂解，以释放细胞内的蛋白质。
常用的裂解方法包括化学裂解、机械裂解和冻融裂解等。
1.3 蛋白质浓度测定。
使用蛋白质浓度测定方法，确定裂解后样本中的蛋白质浓度。
这可以帮助您确定用于后续实验的样本量。
2. 免疫沉淀（IP）实验步骤IP实验是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后利用抗体的亲和力将目标蛋白质从混合物中沉淀下来。
以下是IP实验的步骤：图1。
2.1 抗体固定。
将特异性抗体固定在适当的固相载体上，如蛋白A/G琼脂糖或磁珠。
这些抗体将与目标蛋白质结合。
2.2 样本孵育。
将裂解后的样本与固定的抗体孵育，使目标蛋白质与抗体结合。
2.3 免疫沉淀。
通过离心或磁力分离的方法，将与抗体结合的目标蛋白质沉淀下来。
这一步骤可以去除其他非特异性结合的蛋白质。
2.4 洗涤。
洗涤沉淀后的蛋白质，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
2.5 蛋白质析出。
将洗涤后的蛋白质从固相载体上析出，以获得纯化的目标蛋白质。
3. 共免疫沉淀（CO-IP）实验步骤CO-IP实验是在IP的基础上，通过特异性抗体结合的目标蛋白质来寻找与其相互作用的蛋白质。
【精品】免疫共沉淀coip实验操作步骤(可编辑)
免疫共沉淀C o-I P实验操作步骤------------------------------------------作者------------------------------------------日期免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
核蛋白co-ip实验步骤
核蛋白co-ip实验步骤核蛋白共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，简称Co-IP）是一种常用的生物化学实验技术，用于研究蛋白质相互作用和复合物的组成。
这篇文章将详细介绍核蛋白Co-IP实验的步骤，并一步一步回答。
第一步：制备样品和抗体在进行核蛋白Co-IP实验之前，首先需准备样品和相应的抗体。
样品可以是细胞提取物或组织提取物。
制备提取物的方法取决于研究对象和研究目的。
1. 细胞提取：培养细胞并使用细胞裂解缓冲液（通常包含盐、洗涤剂和其他增效剂）裂解细胞膜并释放细胞质和核质提取物。
2. 组织提取：将组织样品切碎，然后使用相同的细胞裂解缓冲液使组织细胞释放其细胞质和核质提取物。
抗体的选择很重要，应使用特异性高的抗体，以确保Co-IP的特异性和准确性。
第二步：预清洗蛋白质A/G琼脂糖磁珠蛋白质A/G琼脂糖磁珠是一种常用于Co-IP实验的材料，能够特异地结合免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA）。
在开始Co-IP实验前，需要预清洗蛋白质A/G琼脂糖磁珠。
1. 将蛋白质A/G琼脂糖磁珠分配到各个离心管中，每个离心管中加入适量的洗涤缓冲液（通常为PBS或TBST）。
2. 用转磁器将蛋白质A/G琼脂糖磁珠与洗涤缓冲液充分混合，然后将管离心。
3. 弃去上清液，再次加入洗涤缓冲液，重复该步骤至少三次，以确保蛋白质A/G琼脂糖磁珠彻底清洗。
第三步：共免疫沉淀共免疫沉淀实验重点在于使用抗体结合目标蛋白质，然后将这些复合物沉淀下来。
以下是核蛋白Co-IP的步骤：1. 将预清洗的蛋白质A/G琼脂糖磁珠分配到离心管中，再加入适量的洗涤缓冲液，离心去除上清液。
2. 使用适量的抗体将其与蛋白质A/G琼脂糖磁珠结合，在室温下轻轻摇晃，使抗体充分结合到磁珠上。
3. 将待测样品加入配有抗体的蛋白质A/G琼脂糖磁珠并在常温下摇晃，使目标蛋白质结合到抗体上。
这个步骤可以持续数小时至一夜，以确保适当的结合。
4. 使用磁力架，将含有抗体-样品复合物的磁珠沉淀到管底。
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。
实验操作步骤：1.样本准备组织和细胞是最常见的样本类型。
组织用液氮研磨，研磨时少量多次加入液氮，研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，需戴护目镜或是头盔。
细胞直接消化或刮下离心，预冷1XPBS清洗1-2次，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相基本可忽略。
2.细胞裂解使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液会使蛋白变性，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100。
3. 磁珠清洗及抗体孵育磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可。
4. 磁珠-抗体-裂解液孵育此为核心步骤，磁珠与抗体孵育完成后，buffer清洗3次，加裂解液。
清洗是为去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。
磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。
放置4℃，颠转过夜。
5.清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物关键步骤，需清洗6次，清洗少了会导致假阳性，清洗次数过多结合蛋白损失大，清洗时要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。
6.检测检测分为三种，根据实验目的区分。
一是银染：按照input组、目的组、IgG 组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；二是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；三是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。
co-ip方法描述
Co-IP（共免疫沉淀）是一种分子生物学实验方法，用于研究蛋白质相互作用。
它可用于确定在细胞或生物样本中特定蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
以下是一般性的Co-IP 方法描述：1. 样本准备：-收集细胞或组织样本，并使用适当的缓冲液（如RIPA缓冲液）裂解细胞膜并释放蛋白质。
2. 预处理样品：-加入蛋白酶抑制剂和其他必要的添加剂，以防止蛋白质降解。
3. 免疫沉淀：-添加抗体（已知结合目标蛋白质的抗体）至样品中，进行共免疫沉淀。
此过程中，抗体将与目标蛋白质结合，形成抗体-蛋白质复合物。
4. 加入蛋白A/G琼脂糖：-将蛋白A/G琼脂糖或其他亲和层析介质加入到样品中。
蛋白A/G琼脂糖能够结合抗体，并将其沉淀下来，带走与抗体结合的蛋白质。
5. 洗涤：-对琼脂糖沉淀物进行多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物。
6. 洗脱：-通过使用洗脱缓冲液，将与抗体结合的目标蛋白质从琼脂糖中洗脱出来。
7. 分析：-对洗脱的蛋白质进行进一步的分析，如Western blotting。
可以使用适当的抗体来检测与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质。
8. 对照实验：-进行对照实验，包括使用非特异性IgG作为负对照，以评估免疫沉淀的特异性。
注意事项：-实验中要使用高质量的抗体，以确保实验的准确性和可靠性。
-应用适当的对照实验，以帮助鉴别真正的特异性信号。
-选择合适的洗涤条件，以最大限度地减少非特异性结合和背景信号。
Co-IP 是研究蛋白质相互作用的有力工具，可用于阐明细胞信号传导通路、蛋白质复合物的形成等生物学问题。
免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation的实验操作流程
免疫共沉淀所需试剂：1、Protein A 与Protein G 的选择：（1）Rabbit 来源的抗体的使用Protein A（2）大部分Mouse 来源的抗体Protein A 与Protein G 均可使用，但是mouse IgG1 和mouse 多抗来源的抗体必须使用Protein G2、细胞裂解液：Tris-triton：40mM Tris120mM NaCl1%Triton X-100Tris-triton：50mM Tris150mM NaCl1%Triton X-100Tris-NP40：50mM Tris150mM NaCl1% NP40（该裂解液用于普通IP ）HEPES-CHAPS ：40mM HEPES120mM NaCl0.3% CHAPS（该裂解液用于mTOR 复合物的特殊蛋白与蛋白间的IP ）对于核蛋白，Thermo有不破坏蛋白生物活性的提取核蛋白的试剂盒（PIERCE 78833，78835），但所得的蛋白为高渗溶液，直接做CO-IP会造成假阳性，需用透析管或透析卡透析后，方可用于后续实验。
使用时均加入:1mM的NaF （200×）200mM NaF1mM的Na3 VO4 （200×）200mM Na 3 VO41×Cocktail （50×）Cocktail可选择性加入：EDTAPMSF七、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）1. 裂解细胞：取两盘长的较满的细胞，放在冰上，用冰的PBS 洗3 遍，吸净剩余的PBS 残液，加入1ml 的细胞裂解液，在冰上晃动30min ，最后用细胞刮刮取，收集细胞裂解液到两个EP管中（必要时快速过1ml的注射器针头）；2. 离心：14000g，4°C ，离心15min 。
离心空当时( 以每ml裂解液入40ul的protein A 或protein G)，用上述的细胞裂解液1ml洗涤protein A 或proteinG ，洗涤3 次，放入冰箱备用；3. Pre-clear ：吸取上清液每管50-100ul 到新的EP管中，作为Input，放入冰箱-20°C备用，将剩余的上清液吸入含有预处理过的protein A 或protein G 的EP管中，做pre-clear （去除与protein A 或protein G 非特异结合的蛋白），在4°C 摇床上反应1h；4. 离心：快速离心20-30s ，使protein A 或protein G 沉淀下来，吸取上清到新的EP管中，弃去protein A 或protein G ；5. 抗体反应：加入相应的抗体及同源的对照抗体，4°C 摇床过夜；6. 加入新的预处理过的protein A 或protein G ：4°C 摇床上反应1h；7. 离心：快速离心30s 使protein A 或protein G 沉淀，弃上清，用裂解液洗涤protein A 或protein G 3 次。
免疫共沉淀Co详细步骤教程.pptx
10.加入一定体积的兔抗到 500μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同 细胞系中的多少而异
11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议 用 2 h 室温孵育
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免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一 性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白 质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前 多用精制的 prorein A 预先合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原 的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。这 种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白 质的新的作用搭档。
RIPA Buffer 配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能 够 使酶变性，导致活性丧失。
12.加入 100μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗 体混合物过夜或室温 1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 μl"过渡抗体" （兔抗鼠 IgG，兔抗鸡 IgG）
CO-IP-MS实验步骤：从样本处理到蛋白质相互作用分析
CO-IP-MS实验步骤：从样本处理到蛋白质相互作用分析蛋白质相互作用是细胞内许多生物过程的关键步骤。
为了研究蛋白质相互作用，科学家们发展了许多实验方法。
其中，免疫共沉淀质谱（Co-IP-MS）是一种常用的技术，可以帮助我们鉴定和分析蛋白质间的相互作用关系。
本文将详细介绍CO-IP-MS实验步骤，帮助读者了解这一重要的生物药物研究技术。
步骤一：样本准备在进行CO-IP-MS实验之前，首先需要准备样本。
样本可以是细胞提取物、组织提取物或体液等。
以下是样本准备的基本步骤：1.细胞培养：如果使用细胞样本，首先需要培养细胞并使其达到适当的生长状态。
2.细胞裂解：将细胞收集并使用裂解缓冲液裂解细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度测定方法确定样本中的蛋白质浓度。
步骤二：抗体选择和免疫共沉淀在CO-IP-MS实验中，选择适当的抗体是至关重要的。
以下是抗体选择和免疫共沉淀的步骤：图1。
1.抗体选择：根据研究目的选择与目标蛋白质结合的特异性抗体。
2.免疫共沉淀：将抗体与样本中的蛋白质进行共沉淀。
这可以通过将抗体与蛋白质混合，然后使用蛋白质A/G琼脂糖或磁珠等材料进行免疫共沉淀。
步骤三：洗涤和洗脱在完成免疫共沉淀后，需要进行洗涤和洗脱步骤以去除非特异性结合的蛋白质。
以下是洗涤和洗脱的步骤：1.洗涤：使用洗涤缓冲液多次洗涤免疫共沉淀复合物，去除非特异性结合的蛋白质。
2.洗脱：使用洗脱缓冲液将目标蛋白质从免疫共沉淀复合物中洗脱出来。
洗脱缓冲液的选择取决于实验需求。
步骤四：质谱分析在CO-IP-MS实验的最后一步，需要对洗脱出的蛋白质进行质谱分析。
以下是质谱分析的步骤：图2。
1.蛋白质消化：使用适当的酶对蛋白质进行消化，生成肽段。
2.质谱仪分析：将消化后的肽段通过质谱仪进行分析。
质谱仪可以根据肽段的质量和荷电量来确定其序列和标识。
通过CO-IP-MS实验，科学家们可以研究蛋白质间的相互作用关系，揭示细胞内复杂的信号传导网络。
免疫共沉淀Co-IP
百泰派克生物科技
免疫共沉淀Co-IP
免疫共沉淀，简称Co-IP，是一种广泛应用于发现和检测蛋白质与蛋白质相互作用的技术，优点是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
百泰派克生物科技提供Co-IP分析蛋白互作的服务。
Co-IP技术通过利用某一特定蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体间接捕获与该诱饵蛋白结合的蛋白，来鉴定天然状态下的蛋白与蛋白相互作用。
作为免疫沉淀（IP）实验技术的一种，Co-IP实验不仅可以捕获和纯化主要目标-诱饵蛋白，而且还可以捕获和纯化通过天然相互作用与诱饵蛋白结合的其他大分子。
相对于其他鉴定蛋白质互作的方法，Co-IP的优点主要是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
免疫共沉淀（Co-IP）实验步骤
免疫共沉淀实验主要包括了4个步骤：1.制备蛋白质混合物（细胞裂解液或组织提取物）；2.用结合有特异性抗体的亲和珠孵育蛋白质混合物；3.通过多个洗涤步骤清除未结合的蛋白质；4.通过SDS-PAGE，蛋白质印迹或质谱（MS）分析检测相互作用蛋白。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
泛素化coip免疫共沉淀步骤 -回复
泛素化coip免疫共沉淀步骤-回复泛素化co-IP（免疫共沉淀）是一种常用的实验技术，用于研究细胞中蛋白质的相互作用以及泛素修饰的机制。
在这篇文章中，我们将一步一步地介绍泛素化co-IP的操作步骤。
第一步：细胞的处理和裂解在进行泛素化co-IP实验之前，我们首先需要处理和裂解细胞。
细胞可以通过机械剪切、化学裂解剂或超声波等方法进行裂解。
这个步骤的目的是破坏细胞膜，并释放细胞内的蛋白质。
第二步：抗体的选择和固定在本实验中，我们的目标是研究泛素修饰的蛋白质。
因此，我们需要选择一种针对泛素的抗体以进行免疫共沉淀实验。
先进行预先固定泛素抗体，可选择将其与蛋白A/G磁珠/琼脂糖绑定，然后用磷酸盐缓冲液将其洗净。
第三步：抗体的交联和洗脱将固定的抗体与大肠杆菌表达的GST-泛素或HA-泛素融合蛋白质进行反应，以形成抗体-蛋白质复合物。
然后，使用交联剂将复合物固定在琼脂糖珠上。
接下来，使用酸洗脱剂洗脱非特异性吸附的蛋白质，并用洗涤缓冲液冲洗珠子。
第四步：细胞裂解物的孵育和免疫共沉淀将处理好的细胞裂解物加入到经交联的琼脂糖珠上，并进行孵育。
这样，目标蛋白质和与之相互作用的蛋白质可以与泛素抗体结合。
孵育完成后，使用洗涤缓冲液反复洗涤琼脂糖珠，以去除非特异性结合的蛋白质。
第五步：泛素化蛋白质的检测将免疫共沉淀得到的复合物进行蛋白质分析。
可以通过Western blotting 等方法检测泛素化蛋白质的存在与数量。
如果要进一步分析蛋白质相互作用，还可以使用质谱分析等方法鉴定免疫共沉淀得到的蛋白质。
第六步：数据分析和结果解读最后，我们需要对实验结果进行数据分析和解读。
通过比较实验组和对照组的差异，我们可以确定特定蛋白质与泛素修饰的相互作用。
此外，我们还可以进一步研究这些相互作用的生物学功能以及与疾病相关的影响。
总结：泛素化co-IP是一种用于研究蛋白质相互作用和泛素修饰机制的重要实验技术。
通过细胞的处理和裂解、抗体的选择和固定、抗体的交联和洗脱、细胞裂解物的孵育和免疫共沉淀、泛素化蛋白质的检测以及数据分析和结果解读等步骤，我们可以获得有关泛素化蛋白质相互作用的宝贵信息。
深层次了解免疫共沉淀(CoIP)
一、免疫共沉淀实验
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
区别于IP实验，CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）
二、实验过程
1、提取蛋白。
2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。
3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)。
若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G"
4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
（xy抗原、x抗体）。
5、western blot分析，质谱分析。
三、CO-IP特征
优点：
1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
3、抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性）。
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免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤
一、原理：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：
预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，
0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）
4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减
掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插
冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白
在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h
室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合
物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔
抗鸡IgG）
13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）
15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼
脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶
变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）
EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200mM的储存液，室温保存）。