免疫共沉淀原理及注意事项

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免疫共沉淀

第十六章蛋白与蛋白相互作用分析第一节免疫共沉淀一．实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。

其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。

如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。

目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。

二．主要仪器和试剂1．主要仪器微量高速4°C离心机；vortex震荡器；垂直混和器；Western blot 所需仪器。

2．试剂（1）蛋白定量试剂盒；抗体；PBS；protein A/G agarose beads；（2）Western blot所需试剂（参考本书第十七章免疫印迹）；（3）NP-40蛋白裂解缓冲液（使用前加入蛋白酶抑制剂）：150mM NaCl，0.5% NP-40，50mM Tris-HCl。

配置500mL 需要：5M NaCl 15mL，10% NP-40 25mL，1M Tris-HCl （pH8.0）25mL。

三．实验步骤1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次(每次大约30sec)，4℃12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。

免疫共沉底

免疫共沉底（CoIP）免疫共沉淀原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被完整的保留了下来。

当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。

再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

免疫共沉淀原理示意图实验步骤：1、实验前准备如下：预冷PBS，RIPA Buffer，预冷离心管、细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），预冷离心机；2、将细胞培养板中的细胞置于冰上预冷，然后使用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；3、根据不同的细胞量加入适量的预冷RIPA Buffer裂解细胞(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)4、将细胞在冰上放置5-10 min，然后使用移液器轻轻吹打细胞，如果细胞没有完全裂解，可以使用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到预冷的1.5 mL EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）5、4℃，14000 rpm离心15 min，立即将上清转移到一个新的预冷离心管中，同时取少量裂解液以备 Western blot 分析；6、剩余裂解液中加如1 μg 相应的抗体，4°C缓慢摇晃孵育过夜；7、取10 μl protein A 琼脂糖beads，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；8、将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖beads加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖beads偶连；9、免疫沉淀反应后，在4℃条件下以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖beads用1 ml 裂解缓冲液洗3－4 次；最后加入15-20 μl 的1×SDS上样缓冲液，100℃煮5 min；10、SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。

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Leabharlann 10% glycerol（甘油）,
0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性）阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
注意的问题：1.裂解液

细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞
的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解
液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer
可能原因上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度 3.抗抗体亲合力太低：选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合：选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液处理方法 1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异
性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads ProteinA/G-garose beads 非共价健结合共价结合

免疫沉淀实验原理

免疫沉淀实验原理
免疫沉淀实验是一种常见的生物学实验方法，主要用于分离和富集含有特定蛋白质的物质。

下面将介绍该实验的原理。

一、免疫沉淀实验的基本原理
免疫沉淀实验基于抗原与特异性抗体的相互作用关系，实现对目标蛋白质的富集。

该实验通常包括以下步骤：
1. 抗原与抗体的结合
在样本中加入特异性抗体，让其与待分离的蛋白质结合形成免疫复合物。

2. 富集免疫复合物
加入一定量的胶体（如聚丙烯酰胺凝胶），通过离心或过滤等方式，将形成的免疫复合物与非特异蛋白质分离。

3. 分析蛋白质
将富集得到的免疫复合物进行进一步的分析，如Western blot、质谱鉴
定等。

二、免疫沉淀实验的优点
1. 可以选择与特定抗体结合的蛋白质，并去除大量并非兴趣蛋白的杂质。

2. 对于目标蛋白含量低的样本，免疫沉淀实验可以提高其检测的灵敏度。

3. 具有良好的特异性和选择性，可以避免其他方法的假阳性结果。

4. 可以分离出兼具活性和稳定性的蛋白质。

三、免疫沉淀实验的注意事项
1. 需要选择高质量的抗体，以确保免疫复合物的特异性和稳定性。

2. 实验条件要求严格，包括抗体、反应物、离心速度和时间等方面。

3. 免疫沉淀实验需要一定的经验和操作技巧，如样品处理、自制抗体及其金标记反应。

4. 需要对结果进行验证和比对，并结合其他实验结果进行解释。

以上是免疫沉淀实验的原理、优点以及需要注意的事项，了解清楚这
些信息可以让我们更好地开展免疫沉淀实验，并取得准确可靠的结果。

免疫共沉淀原理及注意事项

免疫共沉淀原理及注意事项免疫共沉淀 (immunoprecipitation) 是一种分离和富集特定抗原蛋白的技术。

该技术主要基于抗体与目标抗原的特异性结合，通过纯化富集目标抗原蛋白，可用于研究蛋白相互作用、鉴定异源蛋白、检测蛋白亚细胞定位和富集一些低丰度蛋白等。

1.样品制备：首先需要提取含有目标抗原的样品，如细胞裂解液或组织提取液。

样品应当经过适当的处理，如去除细胞碎片和大分子物质。

2.抗体结合：将目标抗原蛋白与对应的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

3.抗原免疫沉淀：将抗原-抗体复合物与抗体的固相支持物结合，如蛋白A/G琼脂糖或磁珠。

通过低速离心或磁力分离的方式，使抗原-抗体复合物沉淀下来。

4.洗涤：多次使用洗液清洗抗原-抗体复合物的沉淀，以去除非特异性结合的蛋白和杂质。

5.沉淀释放：通过加入溶解沉淀物的缓冲液，将沉淀物中的目标蛋白释放出来。

6. 分析和检测：释放出的目标蛋白可以通过各种定性和定量方法来进行分析和检测，如SDS-、Western blot、质谱等。

1.抗体选择：应选择针对目标抗原的特异性抗体，并确保该抗体的结合效能和亲和力足够强。

2.防止非特异性结合：在进行免疫沉淀过程中，需要添加合适的负对照组，以确保抗体的特异性和排除非特异性结合。

3.样品制备：样品的制备过程要严格，以避免目标抗原损失或蛋白降解，应注意使用适当浓度的蛋白酶抑制剂，避免酶解。

4.洗涤条件：洗涤步骤中的条件（如洗涤缓冲液的组成、次数和洗涤时间等）需要优化，以保证去除非特异性结合的蛋白质和杂质，同时保留特异性结合的复合物。

5.选择固相支持物：选择合适的固相支持物时，可以考虑抗体结合效果、抗原-抗体复合物的稳定性和沉淀物的后续处理等因素。

常用的固相支持物有蛋白A/G琼脂糖和磁珠等。

6.抗原溶解条件：在沉淀物释放的过程中，正确选择缓冲液的pH值和温度，以保证释放出的目标蛋白的活性和稳定性。

7. 结果验证：通过其他独立的检测手段，如Western blot、质谱等，对免疫沉淀结果进行验证，以排除假阳性或假阴性的可能性，并确保结果的准确性。

免疫共沉淀洗脱的蛋白储存方法

免疫共沉淀洗脱的蛋白储存方法随着生物技术的发展，免疫共沉淀技术在蛋白质相互作用研究以及免疫印迹等领域得到了广泛的应用。

然而，在进行免疫共沉淀实验后，如何储存和保存所得到的蛋白成为了一个重要的问题。

正确的储存方法不仅可以延长蛋白的保质期，还可以保持蛋白的活性和稳定性，为后续的实验提供可靠的蛋白样本。

本文将介绍免疫共沉淀洗脱的蛋白储存方法，希望对相关领域的研究人员提供一定的参考价值。

一、原理简介免疫共沉淀是利用抗原与抗体的专一性结合来富集并鉴定蛋白质相互作用的一种技术。

在进行免疫共沉淀实验后所得到的蛋白，通常需要进行洗脱和储存。

洗脱后的蛋白需要储存在适当的条件下，以保持其稳定性和活性。

二、常见的蛋白储存条件1. 低温储存：通常情况下，洗脱得到的蛋白需要在-20℃或更低的温度下储存。

这样可以减缓蛋白的降解和变性过程，延长蛋白的保质期。

2. 无菌条件：在储存过程中，需要注意防止蛋白样本受到细菌或真菌的污染。

最好在进行免疫共沉淀实验时就使用无菌条件。

3. 避光储存：对于一些易受光照影响的蛋白，需要避免直接阳光照射，可以用铝箔或黑色袋子覆盖储存。

三、常见的蛋白储存方法1. 冻存液储存：洗脱得到的蛋白可以使用冻存液进行储存，常用的冻存液包括甘油、DMSO等。

这些冻存液可以降低冷冻过程对蛋白样本的损伤，提高冷冻后的蛋白保持活性的能力。

2. 液氮储存：对于一些特别容易降解的蛋白，可以选择使用液氮进行储存。

液氮温度极低，可以最大程度地减缓蛋白的降解速度，保持其活性。

3. 冷冻干燥：冷冻干燥是一种将蛋白样本在低温下加压脱水的方法，将蛋白转变为固态，并在低温下保存。

这种方法可以保持蛋白的天然构象和活性，适用于一些活性敏感的蛋白。

四、蛋白储存注意事项1. 防止多次冻融：避免多次冻融对蛋白造成不可逆的损伤，每次使用前需要将其快速解冻并避免长时间保存在室温下。

2. 样本标签：对于不同储存条件的蛋白样本，需要在样本管或容器上标明详细的信息，如储存温度、储存时间和蛋白名称等。

免疫共沉淀实验原理及方法

免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。

免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。

免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。

免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。

蛋白质免疫共沉淀实验

蛋白质免疫共沉淀实验简介蛋白质免疫共沉淀实验是一种常用的方法，用于研究蛋白质与其他分子之间的相互作用，以及寻找特定蛋白质的交互伙伴。

本文将深入探讨蛋白质免疫共沉淀实验的原理、步骤和技术要点，并介绍一些相关的应用和注意事项。

原理蛋白质免疫共沉淀实验基于抗体的高度特异性识别能力，通过将目标蛋白质与抗体结合，然后利用这种结合关系将目标蛋白质与其交互伙伴一同沉淀下来。

在实验中，首先需要将抗体与沉淀材料（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）结合，形成免疫复合物。

之后，通过孵育待测样品与免疫复合物，使目标蛋白质与其交互作用的分子与免疫复合物结合，形成免疫共沉淀产物。

最后，通过洗涤和离心等步骤，将免疫共沉淀产物从其他组分中分离出来，以便进行后续的分析和研究。

实验步骤材料准备•抗体：选择与目标蛋白质高度特异性的抗体，确保抗体质量优良。

•沉淀材料：常用的有蛋白A/G琼脂糖或磁珠，选择适合的材料进行免疫复合物的制备和沉淀。

抗体与沉淀材料的结合1.免疫复合物制备：按照说明书中的方法，将抗体与沉淀材料结合，形成免疫复合物。

2.洗涤步骤：用洗涤缓冲液洗涤免疫复合物，去除未结合的抗体和其他杂质。

样品预处理及共沉淀反应1.样品提取：将待测样品细胞或组织进行裂解，获取细胞或组织液，作为共沉淀的样品。

2.预清：将样品与含有免疫复合物的缓冲液混合，进行预清步骤，目的是去除非特异性结合。

免疫共沉淀1.免疫共沉淀：将经过预处理的样品与免疫复合物混合，进行免疫共沉淀反应。

2.孵育条件：温和的摇床孵育，使目标蛋白质与交互伙伴结合到免疫复合物上。

洗涤和沉淀1.洗涤：用洗涤缓冲液多次洗涤免疫共沉淀产物，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

2.分离：将洗涤后的免疫共沉淀产物进行离心分离，得到免疫共沉淀物。

蛋白质分析和后续研究1.SDS-PAGE：将免疫共沉淀物用SDS-PAGE进行电泳分离，得到蛋白质条带。

2.蛋白质鉴定：通过Western blot或质谱等方法，识别和确定目标蛋白质及其交互伙伴。

基因工程-免疫共沉淀技术

五、应用实例与展望
研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作蛋白
P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症发生约一半是由于该基因的突变失活。
• 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀 • SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物。 • 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行质谱（LC-ESIMS/MS）分析，得到相应的肽序列标签。 • 搜索数据库分析目的蛋白相关数据。
操作步骤示意图
免疫共沉淀的优点
免疫共沉淀的缺点
（1）可能检测不到低亲和
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，
力和瞬间的蛋白质－蛋白质
相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，方法本身具有冒险性。
五、应用实例与展望
• 生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导等均受蛋白质间相互作用的调控。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中。 • 由于蛋白质间相互作用具有重大的意义，因此其检测方法的研究也备受重视。蛋白质相互关系的研究以后会愈来愈多，我们不仅可通过免疫共沉淀技术来证实，还会有更多先进技术值得我们去发现、运用和发展。
免疫共沉淀技术
Co-Immunoprecipitation（CO-IP）
姓名学号
目
1
录
基本概念
原理与应用
2
3 4 5
操作步骤
注意事项应用实例与展望
一、Байду номын сангаас本概念
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）：

免疫共沉淀

免疫共沉淀原理及步骤最近更新时间：2010年11月2日提供商：北京冬歌生物科技有限公司资料大小：0K文件类型：下载次数：0次资料类型：浏览次数：2895次相关产品：详细介绍：免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

使用泛抗体做蛋白免疫共沉淀

使用泛抗体做蛋白免疫共沉淀引言：蛋白免疫共沉淀是一种常用的技术手段，用于研究蛋白质与其他生物分子的相互作用。

传统的蛋白免疫共沉淀通常需要特异性抗体，然而，近年来，泛抗体（pan-antibodies）的使用在该领域中引起了广泛的关注。

本文将介绍使用泛抗体进行蛋白免疫共沉淀的原理、方法和应用。

一、泛抗体的原理泛抗体是指能够识别多个蛋白质的抗体。

与特异性抗体相比，泛抗体可以同时与多个蛋白质发生特异性结合，因此可以用于检测蛋白质相互作用的全景图。

泛抗体的生成通常通过免疫小鼠或兔子等动物，然后从免疫动物的血清中提取抗体。

泛抗体的特异性结合能力通常取决于其免疫动物的免疫状态，因此需要对泛抗体进行筛选和优化。

二、泛抗体的优势1. 高通量：泛抗体可以同时识别多个蛋白质，从而可以在单次实验中检测多个蛋白质的相互作用。

2. 省时省力：对于没有特异性抗体或需要大量特异性抗体的研究，使用泛抗体可以简化实验步骤，节省时间和资源。

3. 探索性研究：泛抗体可以用于初步筛选蛋白质相互作用，为后续研究提供重要线索。

三、泛抗体的应用1. 蛋白质相互作用研究：使用泛抗体可以在全基因组范围内鉴定蛋白质的相互作用网络，帮助解析细胞内复杂的信号传导通路。

2. 疾病标志物筛选：泛抗体可以用于筛选疾病相关蛋白质，发现新的生物标志物，为疾病的早期诊断和治疗提供新的方向和策略。

3. 药物靶点发现：泛抗体可以用于筛选药物靶点，帮助发现新的药物治疗靶点，加速新药的研发过程。

四、泛抗体的方法1. 抗体筛选：通过对免疫动物的血清进行筛选，选择具有高特异性和高亲和力的泛抗体。

2. 免疫共沉淀实验：将泛抗体与样品中的蛋白质进行共沉淀，然后通过Western blot或质谱等技术对共沉淀的蛋白质进行分析和鉴定。

3. 数据分析：对共沉淀实验得到的数据进行分析，筛选出与感兴趣蛋白质相互作用的候选蛋白质。

五、实验注意事项1. 控制实验：进行免疫共沉淀实验时，需要设置阴性对照组和阳性对照组，以确保实验结果的可靠性。

细胞免疫共沉淀

细胞免疫共沉淀一、细胞免疫共沉淀的概念及原理细胞免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，通常用于研究信号转导通路中的蛋白质相互作用。

该技术利用抗体特异性识别目标蛋白，在蛋白质溶液中加入抗体，使其与目标蛋白结合，然后通过沉淀和洗涤步骤将结合的复合物分离出来。

最后通过Western blot或质谱等方法检测复合物中的其他成分。

二、细胞免疫共沉淀的步骤1. 细胞培养和处理：将需要研究的细胞培养并进行特定处理（如药物刺激、基因表达等）。

2. 细胞裂解：将细胞裂解以释放内部蛋白。

3. 抗体结合：加入特异性抗体，使其与目标蛋白结合形成复合物。

4. 共沉淀：加入沉淀剂（如Protein A/G Sepharose beads），使复合物与沉淀剂结合并沉淀。

5. 洗涤：将沉淀物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白和杂质。

6. 脱离：将复合物从沉淀剂上脱离。

7. 检测：通过Western blot或质谱等方法检测复合物中的其他成分。

三、细胞免疫共沉淀的优缺点1. 优点：（1）能够在细胞内检测蛋白质相互作用，可以更真实地反映生物学过程中的情况。

（2）不需要纯化目标蛋白，可以直接在复杂的细胞环境中进行实验。

（3）可以同时检测多个蛋白质之间的相互作用关系。

2. 缺点：（1）可能存在假阳性结果，因为抗体可能会与非特异性结合的蛋白一起沉淀下来。

（2）需要使用特异性抗体，因此需要事先知道目标蛋白并制备相应抗体。

（3）操作比较繁琐，需要多个步骤和设备。

四、细胞免疫共沉淀在生物学研究中的应用1. 研究信号转导通路中的蛋白质相互作用。

2. 研究细胞凋亡、增殖、分化等生物学过程中蛋白质相互作用的变化。

3. 研究病理生理学中蛋白质相互作用的变化，如肿瘤、神经退行性疾病等。

4. 研究药物靶点和药效，寻找新的治疗靶点和药物。

五、总结细胞免疫共沉淀是一种常用的蛋白质相互作用检测方法，可以在细胞内检测蛋白质相互作用。

它具有操作简便、能同时检测多个蛋白质之间的相互作用关系等优点，但也存在假阳性结果可能性大、需要特异性抗体等缺点。

《免疫共沉淀》课件

机制。
研究疾病机制：免疫共沉淀技术可以用于研究疾病机制，了解疾病相关的蛋白质相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作台等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳仪等
实验人员：具备相关实验技能和操作经验的人员
关键因素：抗体浓度、孵育时间、洗涤次数、复溶缓冲液
注意事项：避免非特异性结合、防止蛋白降解、确保实验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白洗涤次数：一般需要洗涤3-5次检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、手套、口罩等个人防护用品
实验过程中，避免直接接触实验材料，使用一次性手套
和镊子
实验结束后，及时清理实验台面，避免污
染环境
实验过程中，如出现异常情况，立即停止实验，并报告实验室负责人
实验结束后，对实验材料进行妥善处理，避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目标蛋白选择特异性抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗脱条件以减少非特异性结合

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项【前言】早期，人们就发现在细胞的生命活动中，DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白质相互作用，很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。

近年来，随着研究的深入，很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊径，深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。

染色质免疫共沉淀（ChIP）作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法，深得人心。

很多人都希望接触和掌握此实验技术，希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制，进而开发相应的药物。

总之，ChIP是一个有效且重要的实验技术。

下面就来聊聊它。

【正文】能够与DNA结合的蛋白有多种，主要分为组蛋白和非组蛋白。

一方面，染色体是由组蛋白和DNA构成的，组蛋白作为染色体的结构蛋白，可以与DNA形成核小体，组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的，因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。

NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。

（核小体结构图）另一方面，非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白，包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等，它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的，发挥完作用可能就及时脱离开了。

ChIP实验原理：在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。

从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分5步：（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联；（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；（5）DNA 纯化回收；（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。

COIP免疫共沉淀实验的注意事项

COIP免疫共沉淀实验的注意事项COIP（co-immunoprecipitation）免疫共沉淀是一种常用的检测蛋白质相互作用的实验方法。

在进行COIP实验时，需要注意以下几点：1.实验前准备：-选择合适的细胞系：确保细胞系是目标蛋白质的表达细胞系，比如过表达目标蛋白质或者具有丰富的目标蛋白质表达的细胞系。

-保持细胞存活性：避免长时间传代，使用健康并且处于对数生长阶段的细胞。

-蛋白质的表达水平：在进行COIP实验前，需要确定目标蛋白质和亲和抗体的表达水平。

2.抗体的选择：-选择特异性好的亲和抗体：确保选择的抗体特异性好，并且不与其他非目标蛋白质结合。

-免交叉反应：使用负对照亲和抗体对实验结果进行验证，排除免交叉反应可能引起的假阳性结果。

3.细胞裂解及蛋白质提取：-避免重复冻融：避免多次冻融细胞裂解液，以减少蛋白质降解和样本间的差异。

-蛋白质提取液的组成和浓度：根据已有文献或经验确定蛋白质提取液的组成和浓度。

-添加溶解蛋白质酶抑制剂：避免蛋白质在提取过程中的降解。

4.免疫沉淀反应：-抗体的免疫复合反应温度和时间：尽量控制固定的温度和时间以确保免疫复合反应的充分和有效。

-预先决定阴性对照反应：使用非特异性抗体或使用无关蛋白质质粒进行阴性对照。

-免疫沉淀液的浓度和组成：根据实验需要调整浓度和组分。

-免疫沉淀反应的pH值：根据目标蛋白质的最适pH值进行调整，确保最佳的沉淀效果。

5.SDS-及蛋白质印迹分析：-蛋白质印迹的修饰抗体：使用特异性好的一抗和二抗，并且需要对这些抗体进行预先检验以确保结果的准确性。

-免疫印迹的阴性对照：使用仅进行一抗或二抗的阴性对照样本，排除非特异性结合引起的假阳性。

-优化蛋白质印迹条件：调整印迹条件以获取清晰的带和最佳的信号。

6.结果的解释和验证：-免疫印迹的验证：使用其他技术如免疫组化、原位杂交等验证免疫印迹结果的准确性。

-实验重复：多次重复实验以确保结果的可靠性和重复性。

核酸蛋白质的免疫共沉淀

核酸蛋白质的免疫共沉淀1. 引言核酸蛋白质的免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于研究核酸和蛋白质之间的相互作用。

通过该技术，我们可以确定特定蛋白质与核酸的结合，并进一步了解它们在细胞功能中的作用。

本文将详细介绍核酸蛋白质的免疫共沉淀的原理、步骤以及实验注意事项。

2. 原理核酸蛋白质的免疫共沉淀是基于抗体的特异性结合原理。

首先，我们需要制备特异性的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

这些抗体可以与我们感兴趣的蛋白质结合。

然后，我们将这些抗体与细胞或组织样品中的蛋白质进行反应，使抗体与特定蛋白质形成免疫复合物。

接下来，我们使用沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）将免疫复合物与其他非特异性的蛋白质一起沉淀下来。

最后，我们可以通过洗涤步骤去除非特异性蛋白质，并分离和检测目标蛋白质。

3. 步骤核酸蛋白质的免疫共沉淀通常包括以下步骤：步骤1：制备样品首先，我们需要从细胞或组织中提取核酸和蛋白质。

这可以通过细胞裂解和离心等步骤来完成。

提取的样品应该是纯净的，没有其他干扰物。

步骤2：抗体选择根据研究的目的，选择特异性的抗体。

这些抗体可以是商业化的抗体，也可以是自制的抗体。

确保抗体的特异性和亲和力。

步骤3：抗体偶联将选择好的抗体与适当的偶联试剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）进行偶联。

这样可以将抗体固定在固相材料上，方便后续的沉淀步骤。

步骤4：免疫反应将偶联好的抗体加入到样品中，与目标蛋白质进行免疫反应。

免疫反应的条件需要根据具体实验进行优化，包括反应时间、温度和缓冲液的选择等。

步骤5：沉淀在免疫反应结束后，添加沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）将免疫复合物与其他非特异性蛋白质一起沉淀下来。

这可以通过离心或磁力分离的方法进行。

步骤6：洗涤将沉淀下来的免疫复合物经过一系列洗涤步骤，去除非特异性蛋白质和杂质。

洗涤的缓冲液的选择需要根据实验要求进行优化。

步骤7：脱离将洗涤后的免疫复合物从固相材料上脱离下来，可以使用低pH或其他适当的方法。