免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

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免疫共沉淀技术原理和操作流程

体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
三、纯化与检测经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条超声波破碎条件的选择
件选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。

免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。

其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。

与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。

不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。

在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。

但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。

（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。

但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。

三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。

若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。

（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。

免疫共沉淀技术原理

免疫共沉淀技术原理免疫共沉淀技术（Immunoprecipitation，简称IP）是一种常用的分析蛋白质相互作用的方法。

该技术基于抗体对目标蛋白质的高度选择性结合能力，使得能够富集含有目标蛋白质的复合物，并进一步用于蛋白质相互作用的研究。

接下来将介绍免疫共沉淀技术的原理和实验过程。

免疫共沉淀技术的原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物，然后通过沉淀技术将免疫复合物从细胞裂解物中分离出来。

通常，实验者需要先对目标蛋白质进行抗体的免疫标记，常用的方法包括对抗体进行染色标记、酶标记或放射性标记。

免疫标记后的抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。

免疫共沉淀技术可以分为直接法和间接法。

直接法是将抗体固定在沉淀材料（如蛋白A或蛋白G的琼脂糖糖珠）上，与细胞裂解物中的目标蛋白质共沉淀。

间接法是在细胞裂解物中，先将目标蛋白质与一种特异性抗体结合，然后再将这种结合后的复合物与固定在沉淀材料上的第二抗体结合。

实验过程中，首先将细胞裂解并制备成可用于免疫共沉淀的样品。

然后加入预先标记的抗体，与目标蛋白质结合形成免疫复合物。

接下来，将沉淀材料添加到样品中，如蛋白A或蛋白G的琼脂糖糖珠。

这些材料能够与抗体的Fc区结合，从而沉淀下免疫复合物。

混合物经过洗涤步骤后，免疫复合物得以纯化。

在纯化后，可以通过不同的方式进一步分析目标蛋白质的亚细胞分布、蛋白质相互作用或修饰状态。

例如，可以使用Western blotting检测特定的蛋白带来确定免疫共沉淀的效果。

此外，还可以使用质谱分析技术对免疫共沉淀的蛋白质进行鉴定。

免疫共沉淀技术的应用广泛，可以用于研究蛋白质复合物的组成、相互作用以及功能。

这项技术在研究细胞信号传导、基因调控和疾病发生机制等领域都有重要的应用。

通过免疫共沉淀技术，研究者可以了解目标蛋白质在细胞中的功能以及与其他蛋白质的相互作用关系，有助于深入理解生物学过程和寻找新的治疗靶点。

综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的蛋白质相互作用分析方法，其原理主要依赖于抗体与目标蛋白质的特异性结合能力。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。

免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程

免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。

免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。

免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。

免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。

免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。

免疫共沉淀试验原理及方法

免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。

首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。

然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。

最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。

1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。

首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。

接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。

随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。

最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。

2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。

首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。

接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。

随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。

最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。

1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。

2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。

3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。

然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。

2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。

3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。

总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。

根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。

免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。

它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。

本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。

该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。

3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。

可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。

同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。

2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。

此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。

3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。

为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。

4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。

可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。

通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。

5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。

洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。

6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

免疫沉淀免疫共沉淀

免疫沉淀免疫共沉淀免疫沉淀和免疫共沉淀是常用的免疫学实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用以及蛋白质的表达水平。

本文将分别介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理、步骤和应用。

一、免疫沉淀免疫沉淀是通过抗体的高选择性与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体和结合的蛋白质分离出来。

其原理是利用抗体与抗原的特异性结合，形成免疫复合物，并通过沉淀剂使复合物从溶液中沉淀下来。

免疫沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。

2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。

3. 沉淀复合物：加入沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠），使免疫复合物沉淀下来。

4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物。

5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。

7. 分析：将沉淀的免疫复合物进行后续分析，如Western blot、质谱等。

免疫沉淀的应用：1. 确定蛋白质间的相互作用：通过沉淀目标蛋白质及其相互作用的蛋白质，可以鉴定蛋白质间的相互作用关系。

2. 鉴定蛋白质的修饰：通过沉淀修饰蛋白质及其相关蛋白质，可以鉴定蛋白质的翻译后修饰。

3. 确定蛋白质的表达水平：通过沉淀目标蛋白质及其相关蛋白质，可以确定目标蛋白质的表达水平。

二、免疫共沉淀免疫共沉淀是在免疫沉淀的基础上进行的一种技术，旨在检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、RNA）之间的相互作用。

其原理是利用抗体与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体、目标蛋白质以及与其相互作用的分子沉淀下来。

免疫共沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。

2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。

3. 沉淀复合物：加入沉淀剂，使免疫复合物及其相互作用的分子沉淀下来。

4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子。

免疫共沉淀实验原理

免疫共沉淀实验原理免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于研究蛋白质间的相互作用。

其原理是利用特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。

这种实验方法常用于研究蛋白质的定位、亚细胞定位、蛋白质复合物的组成以及蛋白质间的相互作用等。

下面将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验的原理可以简单描述为以下几个步骤：1. 抗体结合：首先，选择特异性抗体，该抗体能够与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据实验需求来确定。

将抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物。

2. 免疫复合物的富集：将免疫复合物与磁珠或琼脂糖等固相载体结合，形成免疫磁珠或免疫琼脂糖。

这些固相载体具有良好的亲和力，能够高效地捕获免疫复合物。

3. 样品处理：将待测样品加入到含有免疫磁珠或免疫琼脂糖的溶液中，使样品中的目标蛋白质与免疫复合物结合。

同时，对样品进行适当的处理，如细胞裂解、蛋白质交联等，以保持样品的完整性并增加结合效率。

4. 免疫共沉淀：将含有样品和免疫复合物的溶液进行充分混合，并进行一定时间的孵育，使目标蛋白质与免疫磁珠或免疫琼脂糖结合。

通过外加磁场或离心的方式，将免疫磁珠沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。

5. 洗涤：对沉淀下来的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

洗涤的条件需要根据实验需求进行优化，通常包括洗涤缓冲液的浓度、洗涤次数和洗涤时间等。

6. 析出：将洗涤后的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行脱盐或去除洗涤缓冲液，最终得到含有富集的目标蛋白质及其相互作用蛋白质的沉淀物。

7. 分析：对沉淀物进行进一步的分析，如Western blotting、质谱分析、原位杂交等，以研究蛋白质的相互作用关系、定位及功能等。

总结起来，免疫共沉淀实验是一种通过特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用蛋白质的实验方法。

免疫共沉淀和免疫沉淀

免疫共沉淀和免疫沉淀
“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。

将蛋白通过微珠（纯化介质）进行富集。

免疫沉淀根据检测的目的可以分为免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP)。

免疫共沉淀分析(Co-IP)是免疫沉淀的延伸，基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体；但IP的目标是纯化单一抗原，而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。

如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化得到,通过SDS-PAGE、Western 和质谱等方法鉴定与靶蛋白结合的蛋白。

染色质免疫沉淀(ChIP)用于鉴定基因组中与靶蛋白(如转录
因子和组蛋白)结合的区域。

将蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA,目标蛋白与核酸序列一起被沉淀后通过高通量测序、Southern和PCR等方法进行DNA鉴定。

确定与靶蛋白结合的DNA 片段。

RNA免疫沉淀(RIP)原理与ChIP相似,与靶蛋白结合的RNA被沉淀后,用高通量测序、RT-PCR或Northern等方法对沉淀进行RNA 鉴定。

随着技术的发展,目前磁性微粒已经取代琼脂糖成为免疫沉
淀的首选方法,由于磁性微粒明显小于琼脂糖,因此可以与更多的抗体结合,纯化是可以使用磁力架进行,避免了离心分离可能导致的抗原-抗体结合的破坏,避免了检测目的的损失。

上述各种免疫沉淀的异同总结如下:。

免疫共沉淀原理及实验方法

免疫共沉淀原理及实验方法免疫共沉淀是一种通过使用抗体分子来使特定蛋白质复合物沉淀下来的方法。

在这个过程中，抗体与蛋白质复合物结合，形成抗原-抗体共沉淀复合物。

这种方法可以用于研究蛋白质间的相互作用、检测特定蛋白质的存在以及分离蛋白质复合物等。

1.细胞裂解：将目标细胞或组织加入裂解缓冲液中，破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。

2.抗体结合：将特异性抗体加入裂解液中，与目标蛋白质结合。

3.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物与免疫沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠）结合，形成免疫复合物。

4.洗涤：通过多次洗涤步骤去除非特异性结合物质，以提高免疫复合物的纯度。

5.去除抗原-抗体结合：使用酸性溶液或高盐浓度缓冲液等方式解离免疫复合物，分离出目标蛋白质。

6. 分析：通过Western blot、免疫印迹、质谱等手段对分离出的蛋白质进行分析。

免疫共沉淀的原理是利用抗体与特定目标蛋白质的结合来将其沉淀下来。

抗体通常是由动物制备得到的，可以选择单克隆抗体或多克隆抗体。

在实验中，抗体可以特异性地结合到目标蛋白质的表位上，形成稳定的免疫复合物。

随后，通过与免疫沉淀剂结合，可以使免疫复合物沉淀下来。

免疫共沉淀这种实验方法在生物医学研究中具有广泛的应用，例如检测蛋白质间的相互作用、鉴定细胞中的蛋白质复合物、研究信号转导通路等。

通过免疫共沉淀可以揭示蛋白质的功能和相互作用网络，深入理解生物学过程中蛋白质的功能和调控机制。

然而，免疫共沉淀实验也存在一些局限性。

首先，抗体需具有高度的特异性和亲合力，以保证免疫复合物的选择性。

其次，免疫共沉淀依赖于抗体与目标蛋白质的免疫反应，在一些情况下可能出现低表达的蛋白质无法被充分沉淀的问题。

此外，非特异性结合和高背景信号也会影响实验结果的准确性。

综上所述，免疫共沉淀是一种基于抗体-抗原相互作用原理的实验方法，可用于研究蛋白质间的相互作用和分离特定蛋白质复合物等。

这种方法广泛应用于生物医学研究领域，对于揭示蛋白质功能和调控机制具有重要意义。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种用于分离和富集特定蛋白质的常见实验技术。

它利用抗体的特异性和高亲和力，将目标蛋白与其所结合的抗体共同沉淀下来。

该技术常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、鉴定修饰的蛋白质以及分析蛋白质的上调或下调。

免疫共沉淀的原理基于抗体与抗原之间的特异结合。

通常，首先需要用目标蛋白免疫动物制备抗体，或者使用商业提供的针对该目标蛋白的抗体。

然后，抗体与经过适当处理的细胞或组织提取物一起反应，使抗体能够与目标蛋白结合。

接下来，将抗体和目标蛋白的免疫复合物与可沉淀的载体（如蛋白A或蛋白G）结合，形成稳定的复合物。

最后，通过沉淀，将复合物从其他非特异性蛋白质中分离出来。

1.细胞或组织的处理：将目标细胞或组织用合适的缓冲液裂解，以释放细胞内的蛋白质。

裂解液添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以避免蛋白质降解。

2.抗体与样品的孵育：将抗体加入到裂解液中，使抗体与目标蛋白相互结合。

孵育时间和温度根据具体实验需要而定。

3. 添加载体：添加蛋白A或蛋白G等具有高亲和力的载体，以结合与抗体结合的蛋白质。

蛋白A主要结合IgG的Fab区域，而蛋白G则能结合多种类别的抗体。

4.免疫复合物的沉淀：通过加入沉淀剂（比如蛋白质A/A洗涤缓冲液、蛋白G洗涤缓冲液等）将免疫复合物与载体结合，使其沉淀下来。

通常，将混合物在低温条件下（4℃）离心沉淀，使复合物完全分离。

5.沉淀物的洗涤：将沉淀物洗涤，以去除非特异性的蛋白质和污染物。

洗涤使用的缓冲液通常包括含盐的洗涤缓冲液。

6.沉淀物的溶解：将沉淀物溶解在适当的缓冲液中，以获得目标蛋白。

根据后续的实验需求，选择适当的缓冲液进行溶解。

在免疫共沉淀实验过程中，为了增加结果的可靠性，常常需要进行对照组实验。

控制实验组通常为使用无关的非特异性抗体和样品进行操作，以检验沉淀结果是否为特异性。

总结来说，免疫共沉淀技术是一种有效的蛋白质识别和富集方法。

免疫共沉淀原理及步骤

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法免疫沉淀和免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的抗原-抗体复合物。

这两种技术在生物医学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质的相互作用、分子机制以及疾病的发生和发展过程。

下面将详细介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理和方法。

免疫沉淀是利用抗体的高度特异性与需要研究的抗原结合，然后通过添加固相或固体材料，使抗原-抗体复合物沉淀。

这样可以将目标蛋白质从混合溶液中分离出来，以便于后续的分析和检测。

免疫沉淀的原理可以分为两个步骤：第一步是抗体与目标抗原的结合，第二步是利用固相或固体材料将抗原-抗体复合物沉淀。

免疫沉淀的方法通常包括液相免疫沉淀和固相免疫沉淀两种。

液相免疫沉淀方法是将抗体与需要研究的抗原混合，形成抗原-抗体复合物。

然后通过添加沉淀剂如聚乙二醇（PEG），将复合物沉淀下来。

沉淀后，可以通过离心将沉淀物与上清液分离。

固相免疫沉淀方法则是在固相材料如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠上固定抗体，然后将抗原样品添加到固相材料中，形成抗原-抗体复合物。

复合物通过洗涤去除非特异性结合的物质，然后通过洗脱或酸性条件解离，将目标蛋白质分离出来。

免疫共沉淀是通过利用亲和层析柱或免疫磁珠结合多个抗体分离多个蛋白质复合物的技术。

与免疫沉淀不同的是，免疫共沉淀使用多个抗体同时结合多个蛋白质，以便于研究这些蛋白质之间的相互作用。

免疫共沉淀的原理与免疫沉淀相似，不同之处在于使用了多个抗体来捕获目标蛋白质。

免疫共沉淀的方法通常包括两个步骤：首先，在样品中添加多个抗体，形成抗原-抗体复合物。

然后使用亲和层析柱或免疫磁珠，将复合物沉淀下来。

与免疫沉淀类似，免疫共沉淀也可以使用液相或固相方法进行。

但是，由于需要结合多个抗体，免疫共沉淀的操作更加复杂。

总结起来，免疫沉淀和免疫共沉淀是一种基于抗体特异性的实验技术，用于富集和分离特定的抗原-抗体复合物。

免疫沉淀主要用于从混合溶液中分离目标蛋白质，免疫共沉淀则用于分离多个蛋白质复合物。

免疫沉淀原理及步骤

免疫沉淀原理及步骤
免疫沉淀是一种常用的免疫学实验技术，它主要用于检测特定抗原与抗体的相
互作用。

在免疫沉淀实验中，抗体与抗原结合后形成免疫复合物，通过沉淀技术可以将免疫复合物从混合物中分离出来，从而进行进一步的分析和研究。

本文将介绍免疫沉淀的原理及步骤，希望能对相关实验工作者有所帮助。

原理：
免疫沉淀的原理主要是利用抗体与抗原的特异性结合来实现对特定蛋白质的沉淀。

在实验中，首先将样品与特异性抗体孵育，使抗体与抗原结合形成免疫复合物，然后通过添加沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠）来沉淀免疫复
合物，最后通过洗涤和离心等步骤将免疫复合物分离出来。

步骤：
1. 样品制备，将待检样品进行适当处理，如细胞裂解、蛋白抽提等，获得目标
蛋白质的混合物。

2. 抗体孵育，将特异性抗体加入样品混合物中，使其与目标蛋白质发生特异性
结合，形成免疫复合物。

3. 沉淀，加入沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠，将免疫复
合物沉淀下来。

4. 洗涤，用洗涤缓冲液对沉淀物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

5. 离心，通过离心将沉淀物沉淀到管底，去除洗涤缓冲液。

6. 分析，将沉淀物进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析等，以获取
所需的数据和结果。

总结：
免疫沉淀作为一种重要的免疫学实验技术，广泛应用于蛋白质相互作用、蛋白质纯化等领域。

掌握免疫沉淀的原理及步骤，对于开展相关实验具有重要的指导意义。

希望本文所介绍的免疫沉淀原理及步骤能够为实验工作者提供帮助，使其能够准确、高效地开展免疫沉淀实验，为科研工作的开展提供有力支持。

免疫共沉淀Co-IP步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

(完整版)免疫沉淀法原理及操作

免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋白质间交互作用的生物技术。

这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位中就用到这项技术来纯化ArgBP2蛋白。

其原理是在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharose beads上的proteinA/G，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。

然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。

免疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，一般采用细胞或组织制备的裂解物；第二阶段是对裂解物进行预处理，免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能高，用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白；最后阶段是免疫复合物的形成与纯化，即在预处理过后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。

蛋白A和蛋白G对抗体的Fc段有较高的亲和力。

蛋白A/G与抗体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合的即是纯化的抗原抗体复合物。

具体步骤可以如下进行：（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000r/min离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 r/min速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。

该方法利用抗体与目标蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。

下面将详细介绍免疫共沉淀的实验原理及步骤。

实验原理：在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。

然后将这种特异性抗体抵结的蛋白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。

实验步骤：1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或动物模型中提取目标蛋白。

将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。

2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固相支架。

特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。

3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相支架上的抗体结合。

4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质分子从固相支架上洗脱。

一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。

5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的特异性抵结复合物分离出来。

这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或检测。

6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。

总结：免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或检测蛋白质的方法。

这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。

免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。

干货│免疫共沉淀（CoIP）原理概述及操作流程

干货│免疫共沉淀（CoIP）原理概述及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。

免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。

免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

RIPA Buffer配制基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM 的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100 mM 的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protocol）NaF（200 mM 的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100 ml 的modified RIPA buffe：1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫共沉淀技术原理和操作流程

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