双向电泳步骤--标准操作完整版
(完整版)双向电泳原理与流程
GE Healthcare Life Sciences ——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
2002
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE
1991
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
1973
1978
1982
LKB introduced Immobiline™
1979
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
4/ GE Title or job number /
2/3/2020
Why 2DE?
Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches.
2/3/2020
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
聚丙烯酰胺凝胶双向电泳
（8）平衡: 将推出的一条凝胶条放入盛有10ml平衡液的小烧杯中，
浸泡平衡20 min，然后进行第二向电泳. (9)染色:
另一条胶放入固定液中固定1~2 h，用考马斯亮蓝R250 染色1 h，再用脱色液脱色，观察第一向聚焦效果。
第二向电泳--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电（SDS-PAGE） 1．溶液配制 (1) 30% Acrylamide第二向储液（500 mL/班） 含29.1% (w/v) acrylamide和0.9% (w/v) N,N'-methylene-bisacrylamide，配制方法同第一向储液。 (2) 10% SDS 称10 g SDS用重蒸水溶解，定容到100 mL， 室温存放。
3\操作步骤 ① 将胶置于150ml 40％甲醇－10％冰醋酸中浸泡，摇动 固定过夜。 ② 取出胶，置于120ml 10％甲醇-5％冰醋酸中浸泡，摇 动固定30min。 ③ 用去离子水将胶浸泡、漂洗，第一、二次，每次间隔 20min。 ④ 去离子水摇动漂洗，第三、四次，每次间隔30min换水 一次。 ⑤ 倾出去离子水，加入5μg/ml的DTT溶液120ml，摇动浸 泡30min。
2．实验步骤 (1)组装夹心式玻璃板、制胶支架底座调水平；
取一块长玻璃板和一块带磨口槽的短玻璃板，将短玻璃 板带磨口槽的一边位于上端与长玻璃相对，两玻璃板之间 的左、右两端各放入一条间隔条，对齐，插入玻璃板固定 夹，将上面的固定螺丝拧紧，将此夹心式玻璃板放入制胶 支架底座，插入凸轮，向内侧推入并旋转180º，夹心式玻 璃板即被固定。
聚丙烯酰胺凝胶双向电泳
(4)加样 待凝胶聚合后，用微量注射器吸去覆盖在胶上的 重蒸水。在每根胶柱上加20~30 µL蛋白质样品溶液，然后 再加入覆盖溶液至管口。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
双向电泳泳实验方案
双向电泳实验方案1.双向电泳总蛋白(培养细胞）提取方法：方案一细胞培养在10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。
（折合在六孔板中，每孔加裂解液50μl）之后将样品用超声波细胞破碎仪超声处理超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100-120W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止，处理过程在冰浴中进行，超声处理后，4℃、25000g离心1h。
取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后-80℃冰箱中保存。
（裂解液成分：8mol/L脲，65mmol/L DDT，4％CHAPS，40mmol/L Tris）方案二1.1试剂（1）抽提缓冲液9mol/L脲 5.4g4％CHAPS 0.4g0.5％IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech） 50.0μl50mmol/L DDT 0.077gH2O 加至10ml（2）IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech）(3) 磷酸盐缓冲液（PBS）,冰冻1.2仪器(1) 细胞刮刀（2）离心机（低温，低速）（3）滤纸（4）冰浴装置（5）超速离心机（低温）（6）漩涡混合器1.3细胞培养的GC-1 spg细胞1.4方法1.从培养皿中转移细胞：用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml移液器将培养基和细胞转移至15ml离心管中。
2.480g、4℃离心沉淀细胞5min。
3.弃去上清，勿搅动沉淀要点：操作一下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或震荡时保持细胞在冰上。
4.离心管中加入10ml冰冻PBS,来回吹打重悬细胞。
5.480g、4℃再次离心细胞5min。
6.弃去上清，勿搅动沉淀。
7.重复步骤4-6两次。
8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。
9.用移液器将抽提缓冲液加到离心管中。
依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。
双向电泳操作步骤
3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。
参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。
用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。
离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。
置于冰上裂解2h。
13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。
用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。
加入300μL沉淀剂。
振荡或倒置搅匀。
冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。
保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。
后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。
将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。
在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。
-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。
小心地将上清液移走弃去。
此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。
振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。
双向电泳实验操作流程
双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。
根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。
考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。
2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。
DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。
清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。
3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。
上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。
以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。
说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。
在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。
上样后即可进行IEF电泳。
注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。
一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。
4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。
将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。
双向电泳操作流程
双向电泳完整操作流程仪器：Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机（Beckman Coulter）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare）、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪（GE Healthcare）、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件（GE Healthcare）、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT样品水化液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚兰平衡缓冲液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。
双向电泳实验过程及相关溶液配置
双向电泳实验过程及相关溶液配置一、实验过程1、蛋白质干粉的制备（酚抽法）约1g材料置于液氮中研磨，向研钵中加入4ml提取液，待其熔化后，继续研磨数分钟，转移至离心管中（离心管容量依具体情况而定），加入等体积的pH8.0Tris-饱和酚，涡旋，离心（10000r/min，4℃）10min。
取酚层，加入6倍体积0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，－20℃沉淀2h以上。
离心（15000r/min，4）20min，弃上清液，沉淀用－20℃预冷甲醇洗涤1次，再以丙酮（含2％β－巯基乙醇，－20℃预冷）洗涤2次，－20度干燥，所得干粉置－20度保存待用。
2、样品的溶解取蛋白干粉10mg于1.5ml的离心管中，加入200－250ml裂解液（先加100-200ul左右，用小棒研磨后，再逐次加入余量裂解液，冲洗小棒），振荡1min左右，于35℃水浴2.5小时，15000rpm离心15min，取上清液作为实验备用。
3、Bradford法测蛋白含量1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱2)、设7个浓度梯度制作标准曲线，每个梯度设3个重复，依下表加入1mg/ml BSA、Lysis buffer、ddHO。
(均使用10ml离心管)2管号 1 2 3 4 5 6 71mg/ml BSA(ul) 0 10 20 30 40 50 60 Lysis buffer(ul) 20 20 20 20 20 20 20 ddHO(ul) 980 970 960 950 940 930 920 2BSA含量(ug) 0 10 20 30 40 50 603)、每管加入5ml Bradford工作液，摇匀，5min后测波长595nm下的吸光值。
测定过程中，每测完1管，比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次，然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。
关系的标准曲线方程式：4)、制作BSA含量与OD595Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。
双向电泳--标准操作(完整版)
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程
Bio-rad 双向电泳系统标准操作规程1、目的：正确使用Bio-rad 双向电泳系统，确保Bio-rad 双向电泳系统正常运行。
2、适用范围：Bio-rad 7cm/11cm/17cm双向电泳系统。
3、责任人：双向电泳系统操作人员。
4、程序：4.1、第一向等电聚焦4.1.1、准备工作及注意事项用标配的刷子小心将聚焦盘清洗干净，注意聚焦盘两端的两根电极丝，晾干后备用；根据样品使用合适的水化上样液，对于不同的聚焦盘的上样体积可参考下表：4.1.2、上样4.1.2.1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管，置室温溶解，加入合适的DTT与Bio-Lyte，充分混匀。
4.1.2.2、从小管中取出适量水化上样缓冲液与样品充分混匀。
4.1.2.3、取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
4.1.2.4、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4.1.2.5、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
4.1.2.6、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
4.1.2.7、在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
4.1.2.8、对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
4.1.3、设置程序4.1.3.1、打开电源；4.1.3.2、根据情况选择水化（REHYDRATION），预设的程序（PRESET METHOD），储存的程序（STORED METHOD），新的程序（NEW METHOD）；4.1.3.3、如果只需要水化，选择水化（REHYDRATION）选项，在接下来的界面选择主动水化或者被动水化、水化温度、水化时间；4.1.3.4、如果需要跑完整的程序，选择新的程序（NEW METHOD）, 在接下来的界面选择是否水化，并设置相应的等电聚焦程序，设置完成后，在最后的界面选择总的胶条数、限电流和聚焦温度，然后开始运行程序。
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
双向电泳实验流程
双向电泳实验流程样品制备( Sample preparation ) 固相预制胶条的水化( IPG strip rehydration ) 第一向等电聚焦( IEF)胶条的平衡( IPG strip equilibration )第二向SDS-PAG电泳(SDS-PAGE electrophresis )凝胶的染色及检测( Detection/Staining )PDQuest软件分析(Software analysis )质谱鉴定( Protein identification )目录第一章实验材料1．1 IPG 预制胶条及载体两性电解质1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂1．4 化学试剂1．5 蛋白质Marker1．6 染色试剂1．7 注意事项第二章SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE 凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项ATy -_*双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章实验材料1．1 IPG 预制胶条及载体两性电解质Bio-Rad公司），-20 C冰箱保存，每包12根一）IPG 预制胶条（美国项目规格货号原价（元）IPG 预制胶条pH 3-10 ，7 cm 163-2000 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ，7 cm ，nonlinear （NL）163-2002 799 IPG 预制胶条pH 4-7 ，7 cm 163-2001 799 IPG 预制胶条pH 3-6 ，7 cm 163-2003 799 IPG 预制胶条pH 5-8 ，7 cm 163-2004 799 IPG 预制胶条pH 7-10 ，7 cm 163-2005 799 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，7cm 163-2028 799 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，7cm 163-2029 799 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，7cm 163-2030 799 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，7cm 163-2031 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ，11cm 163-2014 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ，11cm，nonlinear （NL）163-2016 957 IPG 预制胶条pH 4-7 ，11cm 163-2015 957 IPG 预制胶条pH 3-6 ，11cm 163-2017 957 IPG 预制胶条pH 5-8 ，11cm 163-2018 957 IPG 预制胶条pH 7-10 ，11cm 163-2019 957 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，11cm 163-2024 957 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，11cm 163-2025 957 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，11cm 163-2026 957 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，11cm 163-2027 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ，17cm 163-2007 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，17 cm ，nonlinear （NL ）163-2009 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ，17cm 163-2008 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ，17cm 163-2010 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ，17cm 163-2011 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ，17cm 163-2012 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，17cm 163-2020 1079IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，17cm 163-2021 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，17cm 163-2022 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，17cm 163-2023 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，18cm 163-2032 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，18cm，nonlinear （NL ）163-2033 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ，18cm 163-2034 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ，18cm 163-2035 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ，18cm 163-2036 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ，18cm 163-2037 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，18cm 163-2038 1079 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，18cm 163-2039 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，18cm 163-2040 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，18cm 163-2041 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ，24cm 163-2042 1292 IPG 预制胶条pH 3-10 ，24cm，nonlinear （NL ）163-2043 1292 IPG 预制胶条pH 4-7 ，24cm 163-2044 1292 IPG 预制胶条pH 3-6 ，24cm 163-2045 1292 IPG 预制胶条pH 5-8 ，24cm 163-2046 1292 IPG 预制胶条pH 7-10 ，24cm 163-2047 1292 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ，24cm 163-2048 1292 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ，24cm 163-2049 1292 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ，24cm 163-2050 1292 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ，24cm 163-2051 1292（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4C冰箱保存项目货号原价（元）Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ，40%，10ml 163-1112 1704 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ，40%，25ml 163-1113 2463 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte ，20%，10ml 163-1132 3275 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ，40%，10ml 163-1142 3713 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ，40%，25ml 163-1143 9287 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ，40%，10ml 163-1152 2984 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ，40%，25ml 163-1153 7540 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ，40%，10ml 163-1162 3569 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ，40%，25ml 163-1163 8187Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 3479 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte ，20%，10ml 163-1182 1912Bio-Lyte 5/8Ampholyte，40%，10ml 163-1192 3275Bio-Lyte 5/8Ampholyte，40%，25ml 163-1193 8114（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad 公司），4C冰箱保存项目货号原价（元）100x ReadyStrip Buffer , for pH 7-10 IPG Strips , 1ml 163-2093 744Bio-Lyte 3/10 Ampholyte , 100x, 1ml 163-2094 396100x ReadyStrip Buffer ，for pH 6.8-8.3 IPG Strips ，1ml 163-2095566 100x ReadyStrip Buffer ，for pH 5.5-6.7 IPG Strips ，1ml 163-2096 774100x ReadyStrip Buffer ，for pH 4.7-5.9 IPG Strips ，1ml 163-2097 545100x ReadyStrip Buffer ，for pH 3.5-5.1 IPG Strips ，1ml 163-20985921．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂项目货号报价（元）Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0001 919Protein Assay Kit II ，BSA standard 500-0002 919Protein Standard I, bovine 丫-globulin , 1 bottle 500-0005429 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml 500-0006 690Protein Standard II，bovine serum albumin，1 bottle 500-0007 365Quick Start Protein Assay Kit I ,Bradford 法500-0201 934De Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0111 2281 De Protein Assay Kit n, BSA standard 500-0112 2281 RC DC Protein Assay Kit I , 丫-globulin , Lowry 法500-0121 3183 RC DC Protein Assay Kit II , BSA standard , Lowry 法500-0122 31831．3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂项目Ready-Prep 2-D Cleanup KitReadyPrep Sequential Extraction Kit Tributylphosphine （TBP ），200mM ，0.6ml ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1货号原价（元）163-2130 2533163-2100 2969163-2101 539 1vial 163-2102 1116ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2 ，1vial 163-2103 909 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3 ，1vial 163-2104 646 ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105 3250 ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106 331 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I ，with DTT 163-2107 508 ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII 163-2108 498E.coli Protein Sample ，lyophilized ，2.7mg 163-2110 446ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 287 ProteoMiner Protein Enrichment SmallCapacity Kit 163-3006 3699 ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit 163-2007 5618 Aurum Serum Protein Mini Kit 732-6701 1513 Aurum Affi-Gel Blue Mini Columns 732-6708 1873 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Cytoplasmic/Nuclear) 163-2089 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane I) 163-2088 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane II) 163-2084 2986 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Signal) 163-2087 28151．4 化学试剂项目尿素Urea，250g 尿素Urea，1kgAG 501-X8 (D)Mixed Bed ResinCHAPS ，1gTriton X-100 ，500mlDTT (Dithiothreitol )，1gDTT (Dithiothreitol )，5g Tributylphosphine ( TBP )，200mM ，0.6ml 碘乙酰胺Iodoacetamide，30g 溴酚蓝( Bromophenol Blue )，10g 矿物油( Mineral Oil )，500ml SDS，100gSDS，1kg Tris ，500g Tris ，1kg 低熔点琼脂糖，25g 甘氨酸，1kg 货号161-0730161-0731142-6425161-0460161-0407161-0610161-0611163-2101163-2109161-0404163-2129161-0301161-0302161-0716161-0719161-3111161-0718原价（元）22268527713904212917315391429501298368199181311511360713甘氨酸，2kg 161-0724 1671 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 500g 161-0101 919 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 2kg 161-0103 3411 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 1kg 161-0107 1870 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 5kg 161-0108 8514 甲叉双丙烯酰胺（Bis）, 5g 161-0200 294 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 10g 161-0202 1902 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 50g 161-0203 17361 过硫酸氨(Ammonium Persulfate ), 10g 161-0700 155 过硫酸氨(Ammonium Persulfate )，100g 161-0754 1153 TEMED，5ml 161-0800 207 TEMED，50ml 161-0801 485 甘油Sigma硫尿Sigma1. 5 蛋白质标准品Marker项目货号原价（元）Unstained SDS-PAGE Standards，high range，200 'l 161-0303 689 Unstained SDS-PAGE Standards，low range，200'l 161-0304 689 Unstained SDS-PAGE Standards，broad range，200'l 161-0317 884 Polypeptide SDS-PAGE Standards，200._l 161-0326 692 Prestained SDS-PAGE Standards, high range，500^1 161-0309 689 Prestained SDS-PAGE Standards, low range，500^1 161-0305 689 Prestained SDS-PAGE Standards, broad range，500^1 161-0318 800 Precision Plus Std Unstained，1ml 161-0363 1168 Precision Plus Std Dual Color，500ul 161-0374 1080 2-D SDS-PAGE Standards，500 J 161-0320 1457 IEF Standards，pl range 4.45-9.6，250^1 161-0310 16211. 6染色试剂项目Coomassie Brilliant Blue R-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue G-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ,货号原价（元）161-0400 413161-0406 670161-0435 1440 1L 161-0436 464Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ，4 X 1L 161-0437 1856 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ，1L 161-0438 488Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ，4X 1L 161-0439 1952 Bio-Safe Coomassie Stain ，1L 161-0786 878 Bio-Safe Coomassie Stain ，5L 161-0787 3493 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，200ml 170-3126 2226 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，1L 170-3125 5725 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ，5L 170-3138 16744Silver Stain Kit 161-0443 3933 Silver Stain Plus Kit （质谱兼容）161-0449 28541．7 注意事项1. 双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级，尽量选用进口试剂。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1） 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。
二、实验准备：1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）；2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃；3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
三、样品制备：（一）细胞细胞裂解准备：1、收集细胞，使用大于500g转速离心5min；2、弃去上清，使用washing buffer重悬细胞沉淀，震摇待细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min；3、重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。
细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。
细胞裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT。
临用前加入PMSF后，立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。
2、加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解时的温度为4℃。
3、裂解15-20min后加入DTT。
4、裂解完成后，置于4℃离心机中，以最大转速13200rpm离心30min，取上清，弃沉淀。
上清所含提取的蛋白。
5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。
（二）、组织：组织裂解准备：1、提取动物组织。
提取时务必保证组织的纯度，尽量减少组织混杂，尤其注意血液的混入。
2、使用washing buffer冲洗组织2-3遍，洗净组织的血液、体液、和其他影响实验结果的残留成分。
3、准备研钵，洗净并且烘干，准备适量的组织裂解液，准备充足的液氮，石英砂适量。
组织裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT、 PMSF。
2、将适量石英砂加入到研钵中，加入液氮冷却。
3、将组织放入装有液氮的研钵中，研磨组织，在研磨过程中保证样品在低温状态下。
4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中，在裂解液中迅速加入PMSF，混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。
保持4℃，震荡混匀，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中。
5、裂解15-20min后加入DTT。
6、使用2000g离心10min，吸取上清即为所提取的蛋白，下层石英砂及组织碎片则丢弃。
将上清使用13200g转速离心，弃去沉淀。
（三）、血清：血清样品可直接用于双向电泳实验。
但样品中含有大量的IgG和白蛋白，需要使用试剂盒去除。
四、试剂说明：裂解液成分：溶液中还原剂的含量不要超过20mM。
尿素/硫脲：变性剂，中性促溶剂，促进样品溶解，破坏氢键等次级结构，使所有离子基团暴露在溶液里。
硫脲可以促进膜蛋白的溶解。
尿素在30℃以上容易降解，降解产物异氰酸盐可使样本中蛋白质甲氨酰化，对蛋白质进行修饰，造成等电点改变，形成人为地“斑点串”。
CHAPS:两性表面活性剂，CHAPS是一种非变性的zwitterionic 去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。
CHAPS是两性离子去垢剂，分子结构中具有一个胆酸和硫代甜菜碱。
在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检测膜蛋白的首选去垢剂，CMC值均为8 mM。
常用于于双向电泳等实验。
原理：CHAPS保护蛋白质的天然状态，可溶解膜蛋白，从而互作用。
透析可除去。
SDS：(FW 288.38)离子型去垢剂，裂解力强，基本可以把细胞完全破坏掉。
并且使蛋白变性失活。
不得与强氧化剂混合。
它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。
NP-40：乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40；）很温和的非离子型去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。
尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。
TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。
能力介于NP-40和SDS之间，偏向于NP-40，在保护蛋白活性方面有一定作用。
EDTA：变性剂和稳定剂，通过螯合金属离子有效抑制蛋白酶的活性。
DTT：二硫苏糖醇，还原剂，储液配置：0.4g/mL。
使用浓度约为40mM。
防止蛋白通过巯基氧化聚合，增加蛋白的可溶性。
DTE：二硫赤酰糖醇，与DTT近似，也做还原剂。
ASB14: Amidosulfobetaine 14，TBP:tri-Butyl-Phosphate磷酸三丁酯、三丁基膦，有毒，具有较低的表面张力，难溶于水，常用作消泡剂。
非巯基还原剂，使用浓度为2mM，但溶解性有限，在溶液中不稳定，在样品制备时需DTT联合使用。
脱氧胆酸钠：Sodium deoxycholate，中度变性剂和蛋白溶解剂。
SB3-10：硫代甜菜碱10，诱食剂，甲基供给剂。
DeStreak试剂和DeStreak水化溶液：将蛋白质巯基转变为稳定地二硫化物基团，防止发生非特异性氧化反应，有效减少蛋白质在电泳过程中因再氧化而发生的拖尾，特别是pH7-11的范围内（碱性蛋白质）。
PMSF：苯甲基磺酰氟，储液配置(100mM)：20mg/mL，在水中易失活，使用异丙醇或DMSO配置。
强大的不可逆蛋白酶抑制剂，抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶以及含有巯基的蛋白酶，使用浓度为1mM。
浓度测定：核酸酶（Nuclease mix）：核酸酶的构成是由牛胰腺Dnase 和Rnase以及维持最佳核酸酶活性所必须的各种辅助因子组成。
核酸酶受EDTA的干扰，使用核酸酶时避免加入EDTA。
可与蛋白酶抑制剂（PI）同时使用，但要注意必须选择无EDTA的蛋白酶抑制剂。
（注意：核酸酶试剂组为悬浮液，使用前务必震荡混匀后分装。
）考马斯亮蓝：Coomassie brilliant blue.考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）比考马斯亮蓝R250多二个甲基。
MW=854；λmax=590―610nm。
测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
灵敏度比Lowry 法还高4倍，染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL。
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
R250较敏感，做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色。
染色灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
此方法优点：干扰物质少，K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
蛋白质纯化一、目的：蛋白质纯化的目的在于去除样品蛋白中的盐、糖以及一些大分子杂质，杂质的存在严重影响双向电泳的结果。
二、方法：本实验室蛋白质常用的除杂方法主要有丙酮沉淀、TCA-丙酮沉淀、2D-cLeanup-kit处理。
丙酮沉淀：加入3-4倍体积的-20℃保存的丙酮沉淀大于1小时。
沉淀结束后使用13200rpm转速离心10min，去上清，将ep管置于冰上晾干5min，后用水化液溶解。
TCA-丙酮沉淀：使用含有10%TCA的丙酮溶液（100mL丙酮加入10gTCA（三氯乙酸），也可加入0.07%的DTT）,沉淀方法与丙酮沉淀类似。