聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。

其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。

2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。

(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。

(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。

(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。

(7)脱色液 7％醋酸溶液。

3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。

(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。

SDS-PAGE电泳实验步骤

SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。

⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。

当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。

本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。

同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。

在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。

不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。

聚丙烯跑胶步骤

1.3.3 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）玻璃板的清洗：用蒸馏水将玻璃板清洗干净，擦干水分，再用分析纯的酒精清洗，自然晾干后进行玻璃板的组装。

（2）灌胶：每板胶取50ml 8%的非变性丙烯酰胺溶液于三角瓶中，真空泵抽气10min，在倒入100ml的小烧杯中，加入250ul的10%的APS（0.1g，1ml）和50ul的TEMED，摇匀后立刻灌入组装好的两玻璃板之间。

在灌胶口轻轻插入梳子，避免气泡产生，灌胶完成后放置2h左右让其聚合。

（3）点样和电泳：拔出梳子，将玻璃板安装在电泳槽内，用1xTBE的缓冲液，300V预电泳15min。

后清洗点样空，用微量进样器加4ul PCR样品于梳槽内，300V恒电压3小时左右。

（4）银染：电泳结束后，分开两块玻璃板，取下胶，蒸馏水清洗2-3次，加250ml染色液（1gAgNO3，500ml蒸馏水），轻轻摇动15min，染色结束后用蒸馏水将胶清洗2-3次。

（5）显影：快速加入显影液（5gNaOH，1ml甲醛，500ml蒸馏水）中，摇动至出现DNA条带，再用蒸馏水清洗2-3次。

（6）照相：快速照相保留图片，记录实验数据。

《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。

本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。

1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。

2.试剂（1）水。

（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。

（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。

（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。

（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。

（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。

建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。

（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。

（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。

（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线_概述及解释说明

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述及解释说明1. 引言1.1 概述在生物化学研究领域中，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的技术。

它被广泛应用于蛋白质分子量测定、鉴定和纯化等方面。

准确绘制和使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线对于确定样品中蛋白质的相对分子量非常重要。

1.2 文章结构本文将围绕SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线展开详细阐述与解释，主要包括以下几个部分：引言、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法与步骤解释、建立SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线的实验步骤和要点解说明、结论与展望。

1.3 目的本文的目的是全面介绍和解释SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线的概念、意义和用途。

同时，还将详细阐述如何进行样品制备与处理、凝胶制备与电泳条件的解释以及凝胶图谱分析方法的说明。

此外，本文还会详细描述实验步骤和要点，帮助读者建立SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线，并对结果进行分析和解读。

最后，结论部分将总结研究目的、讨论研究结果的启示和展望未来的研究方向。

通过本文的阐述，读者将能够全面了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线并正确应用于相关实验中。

2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简介SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术。

其基本原理是根据蛋白质的分子量差异，利用SDS（十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的作用，将蛋白质样品分离成不同迁移距离的条带。

2.2 标准曲线意义与用途标准曲线是根据已知浓度的标准样品制备的一系列溶液，通过测定这些溶液在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移距离和色谱峰面积得到。

标准曲线可以在定量分析时用于确定未知蛋白质样品的浓度。

2.3 研究背景与重要性在生物学、医学和生化等领域中，了解蛋白质样品的浓度是很重要的。

使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线可以帮助我们准确计算样品中的蛋白质浓度。

这对于研究蛋白质功能、进行药物研发以及诊断和治疗疾病等具有重要意义。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。

加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。

2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。

等待凝胶聚合。

3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。

4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。

5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。

6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。

7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。

8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。

9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。

10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。

以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。

需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白

4、点样
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA），进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路）提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上，再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM）半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。

30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。

同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。

丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。

N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。

以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。

其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。

2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。

接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。

3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。

用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。

然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。

4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。

在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。

5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。

用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。

6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。

常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。

银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。

7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。

常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。

乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。

8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。

银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】1、取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）：+0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。

Tris-HCL(88,，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。

），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】分离胶separating gel (5mL) ( 1个板1板2板Prescription12%10%%mL mLDel H2O mL mL3mL1.5M Tris-HCL mL mL mL mL mL30%Acry/bis 2 mL mL mL mL单体胶（29.2g+0.8g/100mL）10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uLTEMED2uL2uL(5 uL)2uL 7uL(夏)~8uL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Prescription Volume(2 mL)(2 mL)Del H2O0.5M Tris-HCL 250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳流程

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sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。

二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。

其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。

通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。

三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。

四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。

五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。

根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。

通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。

六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。

本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。

原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。

用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。

在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。

因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。

SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。

Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。

但在具有自由基团体系时，它们聚合。

引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。

化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。

在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。

TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。

这些因素在实际操作时都应予以控制。

光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。

2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。

3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。

4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。

5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。

6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。

7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。

染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。

置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。

此时改用7%醋酸充装在液槽中。

通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。

在我们的试验中省略的染料泳向正极。

脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。

3-4小时脱色完毕。

有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。

这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。

上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。

下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。

上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。

分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。

样品在其中进行电泳和分子筛分离。

蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。

进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。

由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。

（2）缓冲离子成分的不连续性。

(3)电位梯度的不连续性。

(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤.

【跑电泳的步骤】1、取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。

Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。

），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】分离胶 separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL) 1板 2板Prescription 12% 10% 7.5% 3.5 mL 7.0 mLDel H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL 0.91 mL 1.82 mL30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1.3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL）10%SDS 50uL 50uL 50uL 35uL 70uL10%AP 50uL 50uL 50uL 35uL 70uL7uL(夏)~8TEMED 2uL 2uL(5 uL) 2uL 3.5uL uL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Prescription Volume(2 mL) (2 mL)Del H2O 1.4mL 2.1mL0.5M Tris-HCL pH6.8 250uL 375uL30%单体胶 330uL 495uL10%SDS 20uL 30uL10%AP 20uL 30uLTEMED 2uL(5 uL) 3uL(8 uL冬，5 uL夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g； (100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗;然后用清水冲洗干净;待玻璃板晾干后;将1mm 塑料薄片沾少许清水;使其贴在玻璃板上;然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴..2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板;放入垂直支架内;两侧用钢夹使其固定;钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜;两侧选用力度大小适中、对称的钢夹..3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后;倒入支架板底槽中;使其密封即可;然后用吸管吸取少量琼脂溶液;沿玻璃板两边的缝隙内加入;使其密封;待其冷却凝固后备用..二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制1L配方：丙烯酰胺Acr290g 甲叉双丙烯酰胺Bis10g步骤：称取样品;倒入烧杯中用蒸馏水定容至1 L将烧杯置于搅拌器上;使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10ｘTBE溶液的配制1L配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：7.44g步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备一块胶为例配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵AP200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30°;将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜;倒入过程中要避免气泡的产生;发现有气泡产生时;要待气泡消失后再倒入..灌胶完成后;用枪吸取少量水密封胶口;压平胶面..当胶面与水之间有一条明显的界限时;表示凝胶已凝固;可以开始点样电泳..三、点样及电泳1、0.5ｘTBE缓冲溶液的配制量取950ml的蒸馏水;然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处;装瓶摇匀;备用..2、垂直平板电泳槽的安装将制作好的胶放入垂直电泳槽内;凹形玻璃向内侧..选择合适的梳子;轻轻插入玻璃板内;梳子底部与胶面刚好接触为宜..将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈;用钢夹使其固定..倒入0.5ｘTBE缓冲溶液于电泳槽内;以刚好淹没凹形玻璃平口为宜..3、点样用微量移液器吸取1ul的溴酚蓝溶液;根据PCR产物量大小吸取适量样品;点入胶孔内即可..每次加样前;微量移液器要用蒸馏水清洗;以避免交叉污染..为了确保各个胶孔之间都相互隔离;在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端;看是否有渗漏现象;如果有渗漏现象;要重新安装梳子..每块胶都要点上maker标记..4、电泳点样结束后;接通电源;调节电压至300V;90min;时间电泳时间根据PCR产物分子量适当延长..四、染色、显影1、染色液、显色液的配制染色液：0.1%AgNO3..AgNO31g 加水至1L 溶解待用..显色液：2%NaOH..NaOH 20g 加水至1L溶解待用2、取胶把电泳完成后的玻璃板取下;小心拔出梳子揭去凹形玻璃;去掉底部的琼脂凝胶;小心将胶揭下;放入染色槽中3、染色将胶用蒸馏水冲洗2次;倒入适量的染色液;以淹没胶体为宜;计时10min4、显影染色好的胶体;用蒸馏水冲洗2次;倒入显色液用前加3ml的甲醛;轻摇至显出清晰的带为止5、拍照将显好色的胶用水冲洗2次后;置于玻璃板上;在室温下拍照;用于分析处理..。

cdna凝胶电泳过程

cdna凝胶电泳过程CDNA凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术，主要用于分析cDNA 文库中基因的表达水平。

以下是CDNA凝胶电泳的实验步骤、结果分析及应用意义的详细介绍。

一、CDNA凝胶电泳简介CDNA凝胶电泳是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过分析扩增后的cDNA片段大小和数量，了解基因在特定条件下的表达情况。

实验中，样品经过逆转录酶催化合成cDNA，然后利用PCR技术对cDNA进行扩增，最后将扩增产物进行凝胶电泳分析。

二、CDNA凝胶电泳实验步骤1.提取总RNA：首先从细胞或组织中提取总RNA，去除DNA和蛋白质污染。

2.逆转录：将提取的总RNA经过逆转录酶催化合成cDNA。

3.PCR扩增：利用特定引物对cDNA进行PCR扩增，扩增产物为特定基因的表达产物。

4.凝胶电泳：将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据DNA片段大小分离出不同基因的表达产物。

5.染色和拍照：对凝胶进行染色，常用的是银染或荧光染色，然后拍照记录实验结果。

三、CDNA凝胶电泳结果分析1.凝胶分析：通过观察凝胶上的条带，可以了解不同基因的表达水平。

条带亮度与基因表达量成正比，亮度越高，基因表达量越高。

2.数据分析：利用图像分析软件对凝胶条带进行定量分析，计算各基因的表达量。

3.统计分析：将实验数据进行统计分析，得到各基因在特定条件下的表达差异。

四、应用CDNA凝胶电泳的意义1.研究基因表达：CDNA凝胶电泳可用于研究不同条件下基因的表达水平，揭示基因在生物过程中的作用。

2.疾病诊断：通过分析特定基因在疾病状态下的表达差异，有助于发现疾病相关基因，为疾病诊断提供依据。

3.药物筛选：CDNA凝胶电泳可用于筛选药物作用靶点，为药物研发提供线索。

4.基因表达调控研究：CDNA凝胶电泳可应用于研究基因表达调控机制，为基因治疗提供理论基础。

总之，CDNA凝胶电泳作为一种有效的基因表达分析方法，在生物学研究领域具有广泛的应用价值。