环境工程微生物学实验思考题

1在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
答：灭菌前：[1]电热干燥箱中玻璃器皿不要放置地过于紧密，否则会灭菌不够彻底
[2]开始灭菌，设定温度为160℃，当干燥箱中温度达到160℃时，灭菌1~2h
[3]注意干热灭菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故，灭菌时人不能离开灭菌后：
[4]不要立即打开电热干燥箱，否则会因为内外温差过大而引起玻璃器皿的破裂，灭菌结束后应先关闭电源，放置一段时间后再拿出。

2为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间要长？
答：高压蒸汽灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。

干热灭菌也是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。

细胞内蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，菌体受热时环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固就越快，反之含水量少，凝固慢。

因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高，时间更长.
3.高压蒸汽灭菌开始之前为什么要将灭菌锅的冷空气排净尽？灭菌完毕后什么情况下才可以打开锅盖取灭菌物品？
答：排除灭菌器内原有的冷空气原因是：高压锅内存在冷空气时,虽压强达到规定数目,但实际温度却不足,会影响灭菌效果.灭菌完毕后,要等到压强降下来后,将气门慢慢打开,放气.排完气体后,开盖,取灭菌物品.
4、在使用高压蒸汽锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？
答：（1）在灭菌前一定要检查灭菌锅中是否有水，若没有水或水不够要及时加水（最好是去离子水）否则灭菌锅可能会烧干而引起炸裂事故。

（2）灭菌结束后，注意压力一定要降到0，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼烧操作者。

（3）灭菌时，旁边一定要有人观察灭菌锅是否处于正常使用状态。

5.灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
答：防止培养基被污染；防止杂菌影响实验结果
1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？
答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比.
2.列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。

为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作
答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。

一般先用低倍镜找到物象后再换到高倍镜，就只需要用细调节器了。

3.什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。

利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。

4.影响显微镜分辨率的因素有哪些？
答：物镜的NA值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长
5.根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察
答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。

都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。

1、为什么使用不同放大倍数的目镜或者物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
答：因为目镜测微尺在不同放大倍数的目镜和物镜下的大小是不一样的，也就是比例不同，所以要重新校正。

2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：相同。

因为同一菌体的大小是一定的，不同放大倍数的物镜不会改变菌体的实际大小，但物镜的放大倍数越高，目镜测微尺的精确度越高，测量月准确。

1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？
答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；
取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态
同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。

（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；
（3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形；
（4）固定：菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。

注意温度不宜过高，时间不宜太长，否则菌体形态则会发生改变。

（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水流不宜过急，过大，至流出水无色为止；
2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？
答:1、若未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头。

镜头非常精密,被污染后不利于下次观察；2、若未完全干燥，水滴会影响油与玻璃之间折光率，造成视野不够清晰。

3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样呢？
答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。

（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。

（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。

4、为什么细菌染色常用碱性染料？什么情况下用酸性染料？
答：（1）细菌染色常用碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。

（2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。

1．为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？
答：加热促进芽胞着色。

芽胞壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色，芽胞呈无色透明状。

2．若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。

答：a.由于芽孢的壁厚，耐压力比细胞体强。

因此有可能是由于在图片是用力过大，将细胞体的细胞壁压碎，从而使芽孢脱落出来的缘故。

b.也有可能是由于菌体培养时间过久，芽胞正处于复苏阶段，所以大多芽孢都从饱囊中游离出来。

3．用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
答：若玻片不冷却就用水冲洗，会使玻片因突然遇冷而炸裂。

1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。

答：通过观察菌落特征；单个菌落再次划线分离。

2.细菌与酵母菌的菌落有何区别
答：细菌菌落光滑，易于基质脱离；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚且酵母菌的菌落较湿润。