外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2 g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

●工具／原料

全血（以10ml为例）

无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

RPMI 1640培养基（Invitrogen）

胎牛血清（FBS）（GIBCO）

双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）

预先装好异丙醇的冻存盒

●方法／步骤

配制所需的溶液：

a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；

b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；

1．将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；

2. 取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

3.然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合

在一起，每只离心管各10ml稀释血液；

4.2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；

5.PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管

中。

6.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作

的清洗；

7.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；

8.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放

入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

●注意事项

全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。