人外周血单核细胞分离液使用说明
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
⑥加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
⑦加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
⑧细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
灏洋生物全血单个核细胞分离液说明书
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为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管 获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。
3. PBMC 高效离心管（详见PBMC 高效离心管使用说明）【检验方法】全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
首先根据样本量大小，分以下几种情况：一、 使用15ml 离心管时：情况A ：血液样本量小于3ml 时，实验方法如下：1. 取一支15ml 离心管，加入3ml 分离液。
2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g ，离心20-30min （注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色单个核细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层。
人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法
人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法我折腾了好久人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法，总算找到点门道。
咱就说刚开始的时候，我真是瞎摸索。
我知道有密度梯度离心这一步，但具体怎么操作完全没底。
我就按着人家书上说得大概做做看。
比如说，我拿了那个外周血样本，就跟捧着个宝贝似的，不敢乱动乱晃，因为觉得稍微有点差错可能就全完了。
第一次做的时候啊，那个离心的转速我就没设置对。
我就随便设了个看起来比较合理的值，可出来的结果那叫一个惨不忍睹，根本就没看到像样的单核细胞层。
当时我就懵了，这咋回事儿啊这是。
后来我就去查各种资料，发现转速这个事儿大有讲究。
就好比开车一样，快了慢了都不行，离心转速快了，细胞可能就被破坏了，慢了呢，各种细胞又分不开。
还有这个样本采集到开始离心的时间也很关键。
有一次我采集了样本之后，没有立刻处理，在旁边放了好一会儿才开始离心。
结果呢，细胞的状态就已经发生变化了。
那感觉就像你买了新鲜的水果想做水果沙拉，但是放了半天，水果都开始坏了，最后做出来的沙拉肯定也不好吃。
我就吃过这个亏，后来我采集了样本就麻溜儿地开始操作。
在密度梯度离心的时候呢，分层液的比例也很重要。
我试过不同的比例，乱调的时候基本就没有成功过。
正确的比例就像是魔法配方一样，稍微错一点都不行。
这个我是经过了好多好多的试验才确定下来，而且每次配分层液的时候我都小心翼翼的，跟做化学实验那种小心的程度差不多，各种量具都得洗干净，量要精确。
再就是收获单核细胞的时候，这个操作可得轻柔。
我有一回下手太重了，像个大老粗似的，那细胞估计都被我弄伤不少，在显微镜下一看啊，好多细胞都变形不成样子了。
所以在这个步骤上一定要耐心细致，就像从棉花堆里抽丝线一样，得缓缓地、轻轻地把单核细胞给分出来。
再说说洗涤细胞。
这个就像洗菜似的，你得把那些杂质什么的都给冲掉，但是又不能太用力，把菜都冲破了。
我以前洗涤细胞老不彻底，导致最后分析细胞的时候，总是有一些不明不白的东西干扰，背景不干净。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。
二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。
具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
离心条件为2000rpm，20min。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。
观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。
五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。
2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。
3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。
4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。
六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。
在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。
通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。
外周血单个核细胞分离的操作步骤！
外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！简介周⾎单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和⽐重与外周⾎其他细胞不同，红细胞和多核⽩细胞的⽐重在1.092左右，单个核细胞的⽐重为1.075-1.090，⾎⼩板为1.030-1.035。
因此利⽤⼀种介于1.075-1.092之间⽽近于等渗的溶液作密度梯度离⼼，使⼀定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种⾎细胞与单个核细胞分离。
分离⼀、基本原理⼆、试剂与器材1、聚蔗糖—泛影葡胺分层液，Hank’s液，RPMI-1640培养液，肝素。
2、⽔平离⼼机。
三、操作步骤1、取外周静脉⾎，⽤肝素抗凝，加等量的Hank’s液并混匀。
2、将分层液加⼊试管中，⽤量约为⾎量的1/2。
⽤吸管沿管壁缓缓将⾎加⼊分层液⾯上。
3、置于⽔平离⼼机离⼼，1500r/min，10min。
可见绝⼤多数单个核细胞悬浮于⾎浆和分层液的界⾯，呈⽩膜状。
4、⽤尖吸管吸取界⾯的细胞层，置于另⼀试管中，加⼊适量的Hank's液，混匀后以1000r/min，离⼼10min，弃上清。
5、同法洗涤细胞2次。
6、将细胞重悬于RPMI-1640培养液中，4保存备⽤。
四、注意事项1、在分离外周⾎单个核细胞过程中，将稀释⾎液加于分层液上时，要避免冲散分层液⾯，⽽要使之形成良好的界⾯，否则影响分离结果。
2、此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的⽐重。
淋巴细胞淋巴细胞来源于造⾎⼲细胞(hemopoietic stem cell，HSC)。
造⾎⼲细胞可分化成多能前体细胞( multipotent progenitor cell，MPC)，继⽽分化为淋巴样⼲细胞和髓样⼲细胞。
淋巴样⼲细胞可继续发育为成熟的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。
⾻髓、胸腺造⾎微环境是造⾎⼲细胞分化发育的主要场所。
单个核细胞单个核细胞是⾎液⽩细胞中具有单个核细胞的⼀个含糊术语。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
PBMC的分离
PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。
2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。
3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。
注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。
外周血单核细胞分离纯化
实验预备一．人外周血单核细胞分离1.抗凝血的预离心别离取正常人新鲜抗凝全血A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，取得基层沉淀细胞约10～mL。
2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH ～体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。
B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。
另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液警惕而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。
现在稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。
与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心终止后，掏出离心管，可见管中液体已经分层。
管内可见分为4层：最上层是血浆，含部份血小板：第二层为薄薄的白膜层，要紧台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞那么紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜(图21—3)：3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，搜集血浆层和淋巴细胞分离液交壤面的单个核细胞，尽可能全数吸出PBMC。
加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，幸免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。
混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。
注意：还能够先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰着雾状层，然后在把要的部份慢慢吸出来。
第二种方式，比较简单一些。
再用一样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。
再以RPMI-1640 培育基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。
按每毫升血液标本加mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3～4 mL) 从头混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培育2 ～3 h后去除上清，取得贴壁的单核细胞。
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明货号：P8610规格：200ml保存：室温避光储存，有效期至少2年。
产品简介：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090g/ml，血小板为1.030～1.035g/ml。
为此，将葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，调整比重、pH值和渗透压，经过澄清及过滤除菌后制成一种密度在1.077g/ml并且近于等渗的溶液（分层液），经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
人外周血淋巴细胞分离液为带有乳光或微乳光的注射水溶液，主要组成成份是葡聚糖（右旋糖酐）与泛影酸葡甲胺。
适用于从人抗凝血液中分离单个核细胞（主要为淋巴细胞），无菌条件下所分离的细胞可用于免疫学检测。
分离液法说明及图例：取新鲜抗凝血1ml，与生理盐水1:1混匀后，小心加于2ml细胞分离液之液面上；以400g（约1500转/分，半径15cm水平转子）离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层：为血浆层。
第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。
第三层：为透明分离液层。
第四层：为红细胞层。
收集第二层细胞放入含生理盐水4-5ml的试管中，充分混匀后，以400g （约1500转/分）离心20分钟。
沉淀经2次洗涤后即得所需淋巴细胞。
注：提取率约为80%。
注意事项：A．本分离液要求血液为新鲜抗凝血，避免冷冻和冷藏；在收集血液和分离过程中，应注意无菌操作，避免微生物污染。
B．本实验要求，在正常大气压下，分离液、分离样本以及分离环境温度为20℃±2℃。
分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。
细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前可将样本和分离液置于20℃水浴中复温20分钟以保证分离温度。
C．由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存
ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中国医药生物技术协会归口。
本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。
本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。
88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。
外周血单个核细胞分离方法
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等;取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑1细胞纯度；2细胞获得量；3细胞活力；4使用方法的简易程度和本室条件等;目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞;一原理:常用来分离人外周血单个核细胞PBMC的分层液比重是±的聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分层液;Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子量为400,000,当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜;红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中;吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞;二方法:1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液;2.25000rpm离心5-10分钟,吸取上清,取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面;水平离心2000rpm×20分钟;3.离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank"s液,下层主要为红细胞和粒细胞;中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带如下图,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞;此外,还含有血小板;4.用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞;置入另一短中管中,加入５倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640,2000rpm×20分钟,洗涤细胞两次;5.末次离心后,弃上清,加入含有10％小牛血清的RPMI1640,重悬细胞;取一滴细胞悬液与一滴％台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数;单个核细胞浓度细胞数／1毫升细胞悬液＝4个大方格内细胞总数──────────×10４×2稀释倍数46.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计算出活细胞百分率;活细胞数活细胞百分率＝──────×100％总细胞数用本法分离PBMC,纯度在90％以上,收获率可达80～90％,活细胞百分率在95％以上; %DMSO胎牛血清冻存;。
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
外周血单个核细胞的分离注意事项
外周血单个核细胞的分离注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是常见的实验材料，在许多免疫学、细胞生物学等实验中扮演着重要的角色。
然而，PBMCs分离过程中存在许多注意事项。
本文将从实验前准备、样本处理及分离步骤中列举几点需要注意的事项。
1. 实验前准备安全标准PBMCs的分离涉及血液样本采集和处理，需要保证操作人员的安全，防止血液污染。
为此，实验前需要使用防护手套、口罩、护目镜等器材，并制定相关血液样本处理的实验室安全操作规范。
试剂采购PBMCs分离需要许多慢速离心管、离心机、PBS等试剂，需要提前预置备足够的试剂和设备。
2. 样本处理血液处理PBMCs分离需要血液样本。
在血样提取过程中需要注意消毒操作，以及遵循血样相关的法律法规，根据实验需要动物实验和人类样本需要进行严格的伦理、道德审查手续。
推迟凝固血液采样后需要将血液样本尽快抽入慢速离心管中，加入分离液等样品处理操作。
尽可能的避免血液凝固、变质，以保证分离的单核细胞数量和质量。
3. 分离步骤慢速离心PBMCs分离需要慢速离心。
慢速离心的转速和时间是影响分离效果的重要因素。
理论上，慢速离心时间越长，分离效果越好，但是过长的离心时间会影响细胞的活性。
合适的离心强度和离心时间是需要事先确定的。
分离液制备PBMCs分离的关键是分离液制备。
分离液的配方、pH值、浓度等是影响单核细胞分离效果的关键因素。
不同样本需要不同的分离液组合。
为了保证分离效果，同时避免细胞受损，可以在实验前进行样品处理的优化。
总结本文总结了外周血单个核细胞分离的注意事项，包括试剂的准备、血样的处理、慢速离心的参数控制、分离液的配方等。
在实验前，科研人员应制定严格的安全检查标准，并确保实验操作人员的安全、细胞处理质量与数量的稳定。
样本密度分离液说明书
样本密度分离液说明书【产品名称】通用名称：样本密度分离液英文名称：Density Reagent【型号】样本密度分离液（A型）样本密度分离液（B型）【规格】100mL/瓶、250mL/瓶【预期用途】通过密度分离作用，用于样本中不同成分的分离，以便于对样本的进一步分析。
【检验原理】外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090g/ml之间，红细胞及粒细胞的密度较大，为1.092g/ml左右，血小板在1.030～1.035 g/ml之间。
因此利用样本密度分离液产生一定程度的密度梯度，将稀释后的全血平铺于分离液之上。
离心后，红细胞、粒细胞比重大，沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重，漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。
吸取分离液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
【主要组成成分】本产品的主要成份为聚蔗糖和泛影酸。
【储存条件及有效期】未开封室温避光保存，有效期为2年；开封后4℃保存，保质期为6个月。
【样本要求】要求血液为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且在储存、运输、处理过程中避免冷冻。
【检验方法】1.取新鲜抗凝（EDTA、枸橼酸钠或肝素等抗凝剂均可）全血，用等体积等渗溶液（PBS或生理盐水）稀释全血。
2.在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。
分离液、抗凝未经稀释全血、等渗溶液（PBS或生理盐水）体积为1:1:1。
3.室温，水平转子700-800g离心20-30min。
设置较慢的升降速（如果共有十档且第十档为最高档，升降速应该调整到第三档）。
4.离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的白膜，即：单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）层。
小心吸取白膜层到另一离心管中。
5.用等渗溶液（PBS、生理盐水或培养基等）稀释到一定体积，颠倒混匀。
人外周血单核来源的巨噬细胞细胞的诱导与培养方法
人外周血单核来源的巨噬细胞细胞的诱导与培养方法实验前准备：超净工作台、水平式低速离心机、15ml、50ml离心管、细胞吸管、人淋巴细胞分离液、无菌PBS溶液、RPMI-1640细胞培养基。
实验操作步骤：（1）无菌采血10ml左右，注入盛有肝素的抗凝管中，立即轻轻摇匀。
用无菌吸管加入等体积的无菌PBS溶液（RPMI-1640细胞培养基也可）充分混匀。
注:采血后，请尽快开始实验。
（2）准备50ml离心管，用吸管将人淋巴细胞分离液加入到离心管底部。
注意不要碰到管壁。
（3）将稀释后的血液与人淋巴细胞分离液按1：1的比例在距分离液液面0.5cm 处沿管壁缓慢加至分离液上面。
注：该过程一定要慢慢地加，不要打破血液与分离液的界面（4）室温条件下，2500rpm，离心25min。
（5）离心完毕后，此时的外周血由上至下分为四层，分别是血浆层、单个核细胞层、分离液层、红细胞层。
（7）将细胞吸管直接插入灰白层（即单个核细胞层），沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入新的离心管中，用3-5倍体积无菌PBS溶液（RPMI-1640细胞培养基也可）洗涤2-3次，每次2000rpm，10min。
（8）最后一次离心完毕后弃上清液，留下细胞沉淀，即为单个核细胞。
注：一般每ml健康成人血可分离1-2×106个单个核细胞，其中90%以上为淋巴细胞，部分是单核细胞。
（9）用含有10%的胎牛血清（FBS）+20ng/ml的人重组巨噬细胞因子（M-CSF）+1%双抗的1640细胞培养液重悬细胞。
（10）用细胞吸管将重悬的单个核细胞移入细胞培养瓶中，放于37度、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
（11）培养第三天后，用半换液法加入含有10%的胎牛血清（FBS）+20ng/ml的人重组巨噬细胞因子（M-CSF）+1%双抗的1640细胞培养液放于37度、5%二氧化碳的细胞培养箱中继续培养。
（12）人重组巨噬细胞因子（M-CSF）诱导细胞第七天后，显微镜下可看到大量的长条形贴壁细胞，然后用流式细胞术或细胞免疫荧光法来进行单核来源的巨噬细胞细胞鉴定。
人外周血单个核细胞分离液 说明书
分离后分离前 水平离心血浆层 单个核细胞层 分离液层红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书：P9010/P9011200mL本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。
外周血中单个核细胞（PBMC ）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090 g/mL 左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/mL ，血小板为1.030~1.035 g/mL 。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
密度 1.077±0.001g/mL渗透压 290~350 mOsm/kg H2O无菌 0.1μm 滤膜过滤本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
1. 取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS 稀释全血。
2. 在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL 时，加入3mL 分离液；大于等于3mL ，加入等体积分离液。
但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。
如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。
）3. 室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g ）。
4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
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人外周血单核细胞分离液使用说明
产品内容：
试剂Ａ200mL
试剂D200mL
样本稀释液（赠品）200mL
清洗液（赠品）200mL
保存：18℃-25℃保存，有效期两年。
人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。
无菌条件下操作，启封后常温保存。
如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
操作步骤：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况：
情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下：
1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。
如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。
第一层为稀释液层。
第二层为透明试剂D液层。
第三层为环状乳白色单核细胞层。
第四层为透明试剂A液层。
第五层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离
心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。
5.250g，离心10min。
6.弃上清。
7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
8.250g，离心10min。
9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
10.差异贴壁法纯化细胞
（1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：
a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。
b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。
如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。
情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下：
1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。
2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），
离心20-30min。
（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。
加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。
3.剩余步骤同“情况A”中步骤3至步骤10。
注意事项：
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
为获得最佳的实验结果，最好在取血2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。
血液放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.稀释后血液样本体积小于3ml时，试剂A和试剂D用量分别为2ml和1ml。
3.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
4.吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
5.吸取过多的单核细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。