外周血单个核细胞的分离(优质参考)
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
试验五人外周血单个核细胞的分离
免疫学实验免疫学研究所2006年8月目录基础实验部分第一部分非特异性免疫功能检测实验一巨噬细胞吞噬功能试验 (1)第二部分特异性体液免疫实验二抗体的常规检测 (3)实验三酶联免疫吸附实验（ELISA） (11)实验四体外抗体形成细胞的检测 (16)第三部分细胞免疫功能检测实验五人外周血单个核细胞的分离 (19)实验六E-玫瑰花环形成实验 (21)实验七淋巴细胞增殖实验 (22)第四部分免疫病理实验八豚鼠过敏实验 (26)第一部分非特异性免疫功能检测实验一巨噬细胞吞噬功能实验一、原理巨噬细胞（Macrophage,MΦ）作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。
能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。
MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。
在此，介绍两种小鼠腹腔M吞噬功能两种的方法：1．体内法：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射白色念珠菌，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美兰染色，油镜下计数吞噬白色念珠菌的百分数，及观察MΦ内因被杀死而染为蓝色的白色念珠菌的形态、数目，以判断MΦ的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。
2．体外法：在体外将小鼠腹腔MΦ与白色念珠菌按比例混合，温育，以冷美兰染色，油镜下进行观察，观察指标同上。
二、实验材料1．动物：小白鼠（雌或雄，20～22g）。
2．白色念珠菌悬液：接种于沙氏培养基的白色念珠菌，28℃培养18～24h，生理盐水洗下，配成1×107个/ml细胞悬液。
3．无菌6%淀粉、无菌性注射器、针头、Hank’s液（含5%小牛血清）。
4．0.03%美兰（4℃存放）、华氏管、吸量管。
三、实验方法（一）体内法1．试验前3天，小白鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。
2．实验时，每只小鼠腹腔注射白色念珠菌菌液1ml，轻揉腹部，使菌液在腹腔中分布均匀，利于吞噬。
3．30分钟后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用接种环取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03%冷美兰，盖上盖玻片。
外周血单个核细胞
步骤 2 – 洗涤PBMC
用毛细吸管仔细吸取第二层的单个核细胞（灰白色层）
将所得PBMC用洗液（RPMI-1640液或PBS）洗涤一次
2000rpm×10min
用1ml的RPMI-1640或PBS定容细胞，并混匀
步骤 3 –台盼蓝染色PBMC
用100μl加样器吸取已定容混匀的PBMC100μl与100μl的 2%台盼蓝染液混合 用100μl加样器吸取少许加入计数板下，计数
步骤 1 - 分离PBMC
采集静脉血约4ml，加入含0.1ml肝素溶液（125-250U/ml） 的抗凝管中，混匀
吸取2mlPBS置干净试管中，并与抗凝血混匀 吸取3ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，
将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入稀释的抗凝血
离心2000rpm×25min
密度梯度离心分离PBMC
外周血单个核细胞的分离
(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
常用方法
聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)
分离液的密度是关键：1.077 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞 血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红 细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC 密度稍低于分层液,• 故位于分层液界面上,这样就可获得 PBMC。
注：该步骤可省略，不染色而直接计数PBMC
步骤 4 –计数PBMC
1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细 胞总数 4.每ml健康成人血可分离出1×10 数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5×104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据 的2倍。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
实验六_外周血单个核细胞的分离
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，yiye沿试管壁缓慢加入到 2ml分离液中
2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞转化实验
外周血涂片染色
形态学观察
计算转化率
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
血加入到分离液的上层
离心后的单个核细胞层
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活.
• 应用水平离心机.
E-花环形成实验
SRBC
CD2
T
B
• 利用红细胞的吸附作用，以红细胞为指示细胞， 检测外周血中T细胞的数量以及所占比例的一种免 疫吸附实验。
实验六 细胞免疫功能检测
1.外周血单个核细胞的分离 2.E－花环形成实验 3.淋巴细胞转化实验
实验原理：
1.密度梯度离心法
外周血
淋巴细胞分离液
血浆层 淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
离心
分离液 (1.077±0.002g/l) 粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
外周血单个核细胞的分离注意事项
外周血单个核细胞的分离注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是常见的实验材料，在许多免疫学、细胞生物学等实验中扮演着重要的角色。
然而，PBMCs分离过程中存在许多注意事项。
本文将从实验前准备、样本处理及分离步骤中列举几点需要注意的事项。
1. 实验前准备安全标准PBMCs的分离涉及血液样本采集和处理，需要保证操作人员的安全，防止血液污染。
为此，实验前需要使用防护手套、口罩、护目镜等器材，并制定相关血液样本处理的实验室安全操作规范。
试剂采购PBMCs分离需要许多慢速离心管、离心机、PBS等试剂，需要提前预置备足够的试剂和设备。
2. 样本处理血液处理PBMCs分离需要血液样本。
在血样提取过程中需要注意消毒操作，以及遵循血样相关的法律法规，根据实验需要动物实验和人类样本需要进行严格的伦理、道德审查手续。
推迟凝固血液采样后需要将血液样本尽快抽入慢速离心管中，加入分离液等样品处理操作。
尽可能的避免血液凝固、变质，以保证分离的单核细胞数量和质量。
3. 分离步骤慢速离心PBMCs分离需要慢速离心。
慢速离心的转速和时间是影响分离效果的重要因素。
理论上，慢速离心时间越长，分离效果越好，但是过长的离心时间会影响细胞的活性。
合适的离心强度和离心时间是需要事先确定的。
分离液制备PBMCs分离的关键是分离液制备。
分离液的配方、pH值、浓度等是影响单核细胞分离效果的关键因素。
不同样本需要不同的分离液组合。
为了保证分离效果，同时避免细胞受损，可以在实验前进行样品处理的优化。
总结本文总结了外周血单个核细胞分离的注意事项，包括试剂的准备、血样的处理、慢速离心的参数控制、分离液的配方等。
在实验前，科研人员应制定严格的安全检查标准，并确保实验操作人员的安全、细胞处理质量与数量的稳定。
分离外周血单个核细胞的常用方法
分离外周血单个核细胞的常用方法
1 单个核细胞分离
单个核细胞是指人类外周血中的唯一细胞，在医疗和科学研究中有着重要的意义，因此，研究者需要以有效而可行的方式从其他细胞中单独分离出单个核细胞。
2 流式细胞术
流式细胞术是一种可用于快速识别和分离特定细胞类型的工具，是比较常见的单个核细胞分离方法。
它需要一种特殊的支架，可用来将原始血液的细胞在特定底物上悬浮，并將核细胞从其他细胞中区分出来，血液细胞由这种支架移动。
支架接受射流时，可引导其中的细胞以不同的方向流动，以便对它们进行特定的筛选分类。
最后，在特定的位置，需要的细胞可以独立收集，以便进行实验分析。
3 反应性空气层析
反应性空气层析是一种新兴的单个核细胞分离方法，使用反应性气体将血液中的细胞推向表面，然后由计算机识别特定的细胞类型，并将符合要求的细胞以单个状态分离出来。
它可以分离出仍保存临床意义的活性细胞，具有更大的整体分类准确度，还可以用来检测感染细胞和其他癌症标记物。
4 磁性粒子分离
磁性粒子分离是另外一种单个核细胞的分类方法。
它是通过一种
叫做磁性粒子的高度猝灭的物质，将其他类型的血细胞从外周血中分
离出来，以留下核细胞。
它可以用于血液细胞中比较罕见的细胞类型，因为它具有较高的敏感度。
总而言之，流式细胞术、反应性空气层析和磁性粒子分离是分离
人类外周血中单个核细胞的常用方法。
上述方法都可以实现较高的分
离精度，为后续进行系统研究奠定基础。
外周血单个核细胞分离实验报告(共5篇)
外周血单个核细胞分离实验报告(共5篇)
一、实验目的：
本实验旨在掌握外周血单个核细胞分离方法，为后续细胞培养、分子生物学的研究提供有效的前提。
二、实验原理：
外周血单个核细胞分离是一种分离外周血中单个核细胞的方法。
其主要原理是用红细胞裂解缓冲液溶解外周血中的红细胞，然后通过以不同的速度离心，分离出具有不同密度的白细胞，最终获得外周血单个核细胞。
三、实验材料：
1.外周血
2.血红蛋白抑制剂
3.红细胞裂解缓冲液
4.离心管
5.离心机
6.无菌的显微镜玻片和盖玻片
8.荧光显微镜
四、实验步骤：
1.取10mL外周血，添加2-3滴血红蛋白抑制剂管中。
2.将外周血转移至15mL离心管中。
4.轻轻振荡，使红细胞裂解液均匀地与外周血混合。
5.放置于室温下，轻轻振荡10-15分钟，浑浊的混合液会逐渐变得透明。
6.将离心管离心至1200转/分钟，离心10分钟。
7.将上清液取出，用1mL无菌的PBS润洗细胞3次。
8.用荧光显微镜观察细胞的纯度和活性。
五、实验结果：
通过本次分离实验，我们成功地获得了外周血单个核细胞，观察到细胞形态完整，纯度和活性良好。
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。
2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。
B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。
另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。
此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。
与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。
管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。
加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。
混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。
注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。
第二种方法，比较简单一些。
再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。
再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。
按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3～4 mL) 重新混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培养2 ～3 h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
实验1外周血单个核细胞的分离
思考题
分离获得的PBMC如何进行计数？ 从PBMC中进一步分离T、B淋巴细胞，
可采用哪些方法？
3.离心：18℃~22℃，1500 rpm，30 min
实验步骤
4.将最上层血浆层吸弃，沿管壁周缘轻轻吸取 PBMC层移入另一试管中
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1800rpm，离心 10 min ，弃上清
6.重复洗涤一次，1400rpm，离心10min， 弃上清
7.适量的培养基重悬细胞
实验1
外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll密度梯度离心法
实验目的
掌握外周血单个核细胞分离的原理和实际 操作方法
掌握离心机及显微镜等仪器的使用
实验原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利 用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度 离心，使一定比重的细胞群按相应密度 梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
肝素抗凝的外周血 淋巴细胞分离液（Ficoll）：低温避光保存 稀释液：Hanks液 倒置显微镜、离心机 华氏管、吸管、吸球、微量移液器、血球计数
板及盖玻片
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）
2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓 加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
注意事项
每毫升外周血大约可获1×106单个核细胞 Ficoll应适量，外周血应充分稀释 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以
免冲散界面 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清
液或分层液而导致血小板污染等
实验要求
华氏管中加入血样后，用记号笔作好标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计数板
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
14单个核细胞的分离
【结果判断】
活细胞不着色，折光强。而染料可渗入死亡细胞 将其染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞数 应在95%以上。
单个核细胞的分离
【原理】
人外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细 胞，本次实验采用密度梯度离心法分离人外周血 单个核细胞。 红细胞和多形核细胞比重较大，约为1.092， 血小板约为1.032，单个核细胞比重约为1.075。 因此，本实验利用一种比重为1.077等渗的聚蔗 糖-泛影葡胺分离液作密度梯度离心，离心后不 同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。将单个 核细胞层取出，经洗涤后即可用于细胞免疫的某 些试验。
【步骤】
1.取外周静脉血2ml，注入预先加有肝素的离心管中， 混匀，再加入等量生理盐水，混匀。 2.另取一支离心管，加入2ml淋巴细胞分离液，并倾 斜45°角，用毛细吸管将已稀释的血液（约4 ml） 在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分离液 上面，二者之间有一明显界面。 3.2000r/min离心20min。离心后，管内可分为以下四 层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板； 下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分离液；分离 液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞 层。（见下图）
【步骤】
【步骤】
4.用毛细吸管轻轻插到灰白色层，沿试管壁周缘吸取该层 单个核细胞，移入另一试管。 5.加5倍以上体积生理盐水，混匀，1500r/min离心10min， 弃上清。以1ml生理盐水将细胞重悬。 6.细胞计数：（本步骤为选做） 取1滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，一般健康成人 血每ml可分离出1×106～2×106个单个核细胞。 7.细胞活力检测： 取1-2滴细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片， 5min后，显微镜高倍镜下观察。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验二十四外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】
血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】
1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】
1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。
6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。
离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。
7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。
计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
【结果判断】
【注意事项】
1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。
故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。
温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。
离心速度在2000～2500r/min，离心时间为l5～20min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。
4.分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
5.将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。
6.充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。
【应用与评价】
本方法操作简便、稳定。
细胞回收率达80%～90%，单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞活力可达95%以上。
但其中仍可混杂少量(约10%)其它细胞。
该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。
故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。
【思考题】
1.为何常用密度为1.077土0.001的分层液分离人单个核细胞？
2.利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上？
外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法
一、原理
根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。
利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。
已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.090。
因此，若用比重为1.077±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。
二、器材与试剂
器材：
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸
试剂：
（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.077±0.001）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%锥兰生理盐水溶液
三、操作步骤
在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。
将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。
用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。
离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：
用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。
在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。
用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞数（/ml）。
检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单个核细胞中着色的死细胞数。
四、操作注意事项
注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2~1:3为宜。
分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。
加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果。
做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。
五、实验结果记录与分析
通过前后两次细胞计数：
计算细胞回收率（%）
分离后单个核细胞总数×100%
分离前单个核细胞总数
计算单个核细胞纯度（%）
分离后单个核细胞总数×100%
分离后白细胞总数。