实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法哎呀，朋友们，今天咱们聊聊一个特别有意思的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
你可能会问，啥玩意儿？简单来说，就是从咱们的血液里找出一种特别的细胞。
想象一下，这就像在一个巨大的水果市场里，找出你最爱的苹果那样。
1. 什么是外周血单个核细胞？1.1 首先，得跟你解释一下这东西。
外周血单个核细胞，顾名思义，就是咱们血液里的一种细胞，单核的，也就是没有太多复杂的结构。
这些细胞可是咱们身体的宝贝儿，它们能做很多重要的工作，比如免疫应答啊、修复组织啊，所以咱们得小心翼翼地对待它们。
1.2 好了，听上去有点复杂，其实操作起来也没那么难。
咱们只需要用一些科学的工具和方法，就能把这些细胞从血液里分离出来。
这个过程不仅能帮助研究人员更好地了解身体的各种反应，还能在医学上发挥大作用呢。
2. 如何进行分离？2.1 让咱们来聊聊具体的操作步骤吧。
首先，得抽取血液。
哎，这步最让人感到心慌，想象一下那根针头，还是尽量别多想了。
不过别担心，这步过了之后，就进入了最有趣的环节——分离。
血液被抽出来之后，就像把你最喜欢的食材从锅里捞出来一样，要把那些外周血单个核细胞找出来。
2.2 这个过程主要用到的工具叫做离心机。
离心机就像一个超级旋转的机器，把血液转得飞快。
在这高速旋转的过程中，血液里的各种成分会被分离开来，就像咱们在清理菜市场时，把苹果和香蕉分开一样。
离心之后，血液中的细胞就会被分成几层，最上面一层就是咱们的目标——外周血单个核细胞。
2.3 之后，拿到这些细胞，就得用到一些特殊的试剂进行进一步处理。
想象一下，你拿到了一大袋苹果，接下来要把它们洗净、切片，这样才行。
细胞也是一样，需要经过处理和清洗，才能保证它们的纯净和活力。
3. 实际应用3.1 分离出来的外周血单个核细胞可是用途广泛。
比如说，它们在医学研究中，能帮助科学家们了解各种疾病的成因，还能用来开发新的治疗方法。
就像你买了一台新玩具，得先拆开看看里面的零件一样，这些细胞就是研究中的“零件”，帮助咱们了解身体的奥秘。
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。
二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。
具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
离心条件为2000rpm，20min。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。
观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。
五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。
2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。
3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。
4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。
六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。
在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。
通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个有点“高大上”的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
别担心，听起来复杂，但其实就像是把水果分开一样，方法有点多，但都不是很难。
首先，单个核细胞是什么呢？简单来说，它们是血液里的小战士，负责咱们身体的免疫系统工作。
而把这些小战士从血液中分离出来，是为了让我们能更好地研究它们，或者用于治疗各种病症。
现在，让我们一起来看看，这个过程到底怎么做吧！2. 准备工作2.1 收集血液样本首先，得从患者或志愿者那里收集血液。
想象一下，这就像是收集原材料一样。
我们一般用专门的血液收集管，这些管子里有点抗凝剂，防止血液在管子里凝固。
这个步骤就像是给血液穿上“防寒衣”，确保它们不会在实验室里冻住。
血液收集后，我们需要立即将其送到实验室，因为血液可不像冰淇淋那样能在冰箱里存放很久。
2.2 准备离心机接下来，我们用离心机来分离这些细胞。
离心机是一种可以快速旋转的机器，通过离心力把血液中的不同成分分开。
这个过程就像是在一个大旋转舞台上，血液里的各种“演员”根据他们的“舞姿”被分到不同的区域。
大家可以把离心机想象成一个超级有力的“旋转木马”，它能把血液中的细胞按类型分类开来。
3. 分离过程3.1 使用密度梯度离心法密度梯度离心法是我们分离单个核细胞的绝招之一。
我们在试管里加入一个特殊的液体，这个液体的密度不同层次逐渐增加，形成一个梯度。
然后把血液样本倒进去，接着用离心机旋转。
这就像是给试管里制造了一条“滑梯”，细胞们就沿着这个“滑梯”滑到它们各自的位置。
单个核细胞会在某一层次上停下来，其他细胞则会分布在不同的层次上。
3.2 清洗与收集当我们分离好细胞后，下一步就是清洗和收集。
用生理盐水或者其他洗涤液把细胞洗干净，去掉多余的杂质。
这个过程就像是给细胞洗个澡，确保它们干干净净，然后我们把这些清洗好的细胞取出来。
然后就可以把这些细胞用于各种研究或治疗了。
4. 结束语好了，今天的分享就到这里。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
实验六_外周血单个核细胞的分离
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，yiye沿试管壁缓慢加入到 2ml分离液中
2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞转化实验
外周血涂片染色
形态学观察
计算转化率
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
血加入到分离液的上层
离心后的单个核细胞层
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活.
• 应用水平离心机.
E-花环形成实验
SRBC
CD2
T
B
• 利用红细胞的吸附作用，以红细胞为指示细胞， 检测外周血中T细胞的数量以及所占比例的一种免 疫吸附实验。
实验六 细胞免疫功能检测
1.外周血单个核细胞的分离 2.E－花环形成实验 3.淋巴细胞转化实验
实验原理：
1.密度梯度离心法
外周血
淋巴细胞分离液
血浆层 淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
离心
分离液 (1.077±0.002g/l) 粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存
ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中国医药生物技术协会归口。
本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。
本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。
88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
分离外周血单个核细胞的常用方法
分离外周血单个核细胞的常用方法
1 单个核细胞分离
单个核细胞是指人类外周血中的唯一细胞，在医疗和科学研究中有着重要的意义，因此，研究者需要以有效而可行的方式从其他细胞中单独分离出单个核细胞。
2 流式细胞术
流式细胞术是一种可用于快速识别和分离特定细胞类型的工具，是比较常见的单个核细胞分离方法。
它需要一种特殊的支架，可用来将原始血液的细胞在特定底物上悬浮，并將核细胞从其他细胞中区分出来，血液细胞由这种支架移动。
支架接受射流时，可引导其中的细胞以不同的方向流动，以便对它们进行特定的筛选分类。
最后，在特定的位置，需要的细胞可以独立收集，以便进行实验分析。
3 反应性空气层析
反应性空气层析是一种新兴的单个核细胞分离方法，使用反应性气体将血液中的细胞推向表面，然后由计算机识别特定的细胞类型，并将符合要求的细胞以单个状态分离出来。
它可以分离出仍保存临床意义的活性细胞，具有更大的整体分类准确度，还可以用来检测感染细胞和其他癌症标记物。
4 磁性粒子分离
磁性粒子分离是另外一种单个核细胞的分类方法。
它是通过一种
叫做磁性粒子的高度猝灭的物质，将其他类型的血细胞从外周血中分
离出来，以留下核细胞。
它可以用于血液细胞中比较罕见的细胞类型，因为它具有较高的敏感度。
总而言之，流式细胞术、反应性空气层析和磁性粒子分离是分离
人类外周血中单个核细胞的常用方法。
上述方法都可以实现较高的分
离精度，为后续进行系统研究奠定基础。
外周血单个核细胞分离实验报告(共5篇)
外周血单个核细胞分离实验报告(共5篇)
一、实验目的：
本实验旨在掌握外周血单个核细胞分离方法，为后续细胞培养、分子生物学的研究提供有效的前提。
二、实验原理：
外周血单个核细胞分离是一种分离外周血中单个核细胞的方法。
其主要原理是用红细胞裂解缓冲液溶解外周血中的红细胞，然后通过以不同的速度离心，分离出具有不同密度的白细胞，最终获得外周血单个核细胞。
三、实验材料：
1.外周血
2.血红蛋白抑制剂
3.红细胞裂解缓冲液
4.离心管
5.离心机
6.无菌的显微镜玻片和盖玻片
8.荧光显微镜
四、实验步骤：
1.取10mL外周血，添加2-3滴血红蛋白抑制剂管中。
2.将外周血转移至15mL离心管中。
4.轻轻振荡，使红细胞裂解液均匀地与外周血混合。
5.放置于室温下，轻轻振荡10-15分钟，浑浊的混合液会逐渐变得透明。
6.将离心管离心至1200转/分钟，离心10分钟。
7.将上清液取出，用1mL无菌的PBS润洗细胞3次。
8.用荧光显微镜观察细胞的纯度和活性。
五、实验结果：
通过本次分离实验，我们成功地获得了外周血单个核细胞，观察到细胞形态完整，纯度和活性良好。
人外周血单个核细胞分离及T细胞受体的检测-医学免疫学
CD28分子 C 28分 子
细胞因子受体 丝裂原受体
Dep.Immuno.韩艳非 14
2012-10-21
原理
T细胞表面有绵羊红细胞（SRBC)受体，称为E受体(ER)
，ER即为CD2(或LFA-2)。T细胞与SRBC混合孵育，形成 以T细胞为中心，四周环绕SRBC的如玫瑰花样的细胞集 团，称为E-玫瑰花环实验或E-花环形成实验。
2012-10-21
Dep.Immuno.韩艳非
7
实验方法
比重：1.070 包括：单核细胞、淋巴细胞 (>90%)
比重：1.077
Ficoll
比重：1.092
2012-10-21
Ficoll密度梯度离心法分离PBMC Dep.Immuno.韩艳非
8
操作步骤
1. 采血：无菌采血3 ml，注入盛有肝素的抗凝管中，立即轻轻 摇匀。 2. 稀释：用无菌吸管加入等体积的RPMI-1640液充分混匀。 3. 加样：吸取淋巴细胞分层液3ml置于一离心管中，管倾斜45度， 将稀释后的血液在距分层液液面1cm处沿管壁缓慢加至分层液 上面。(NOTE：不要打破血液与分层液的界面) 4. 分离：18～20℃，2500rpm，20min.（四层.>>） 5. 回收：将0.5ml吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层 单个核细胞，放入新的离心管中，用5倍体积1640液洗涤2次， 每次2000rpm，10min.(NOTE：尽量少吸分层液)
5. 6. 7. 8. 取出，弃上清（保留0.1~0.2ml)。轻转离心管，使细胞重悬。 滴加0.8％戊二醛0.1ml，混匀，4℃，15min。 取出，轻旋，重悬细胞，制备血涂片（涂片）。 染色（瑞氏染色>>），镜检。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法外周血单个核细胞的分离方法，听起来好像很高大上，其实咱们日常生活中也会遇到这种情况。
比如说，你想给你家小狗做个血液检查，看看它身体有没有问题，这时候就需要分离出它的外周血单个核细胞，然后送到实验室进行检测。
那么，这个过程到底是怎么实现的呢？别着急，我这就给你一一道来。
我们需要收集小狗的血液。
这个过程很简单，只需要用一根针头把小狗的静脉扎破，让它的血液流到一个容器里就可以了。
为了避免小狗疼痛，我们可以给它打一针麻醉剂，让它在睡梦中完成这个过程。
这样一来，我们就可以得到新鲜的小狗血液了。
接下来，我们需要把这些血液中的红细胞和白细胞分离出来。
这个过程叫做血液学的“洗涤”。
我们可以把小狗的血液放到一个大桶里，然后加入一些特殊的化学物质，让红细胞和白细胞自动分开。
这个过程可能需要几个小时，但是最终我们会得到两层液体：上面是淡黄色的透明液体，里面主要是血小板和各种细胞碎片；下面是深红色的血浆，里面主要是各种白细胞。
现在，我们已经得到了外周血单个核细胞。
这些细胞是一种特殊的白细胞，它们可以帮助我们了解小狗的身体状况。
但是，我们还需要把这些细胞从血浆中提取出来。
这听起来好像很难办到，但是实际上也很简单。
我们可以用一种叫做离心的方法，把血浆放在一个高速旋转的容器里，让血浆中的细胞被离心力甩到容器的壁上。
这样一来，我们就可以得到一层薄薄的血浆膜，里面包裹着各种细胞。
我们需要把这些细胞进一步分离。
这个过程叫做细胞学的“染色”。
我们可以用一种叫做吉姆萨染色液的特殊液体，给血浆膜上的细胞染上不同的颜色。
这样一来，我们就可以清楚地看到各种细胞的结构和功能了。
这个过程可能需要几小时甚至几天的时间，但是最终我们会得到一张精美的细胞图谱，上面记录着小狗身体内各种细胞的数量和状态。
通过以上步骤，我们就成功地分离出了小狗的外周血单个核细胞。
虽然这个过程看起来很复杂，但是实际上只要掌握了正确的方法和技巧，就可以轻松地完成。
实验一 人外周血单个核细胞分离、计数、活力测定及涂片与固定
6. 细胞涂片与固定
• 细胞固定原理
– 固定剂可分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂 如95%乙醇和冷丙酮能够去处脂类物质使细胞脱 水，把蛋白质沉淀在细胞结构上；交联剂如4%多 聚甲醛一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来, 形成一个相互交联的抗原网
– 用交联剂固定细胞效果较好,尤其是做免疫荧光的 时候。但是，单独用多聚甲醛固定的细胞抗体无法 进入细胞内,因此,标本固定后必须用非离子去污剂 (triton-X 100)透化标本。
6. 细胞涂片与固定
• 固定方法
– 混匀细胞悬液，用巴氏管取1滴（约100μL）滴 于防脱载玻片上，推成细胞膜，自然干燥或吹 风机吹干。
– 将载玻片置于4%多聚甲醛中室温下固定30min。 – 用镊子取出玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，
晾干保存于-20℃备用。可长期保存，做实验时， 取出片子，入PBS湿润后即可进行后续免疫组 化或免疫荧光实验。
实验一 人外周血单个核细胞分离、计数、 活力测定及涂片与固定
主讲教师：XXX教授 XXX博士
1. 实验原理
• 外周血中的各种血细胞比重不同，利用密度为1.077g/L±0.001 g/L且 近于等渗的混合溶液（常用的有聚蔗糖-泛影葡胺，又称为FicollHypaque，或淋巴细胞分离液）做密度梯度离心时，各种血细胞将按密 度梯度重新分布。
颠倒摇匀。
2.在15mL的玻璃离心管中加入3.0 mL淋巴细胞分离液.
3.用一次性吸管小心吸取血液沿着管壁慢慢加至分离液的液面上，形 成明显的界面。
4. 600×g(2000rpm)，离心20min。离心后自上至下分四层：血浆 层、环状乳白色淋巴细胞层、透明分离液层、红细胞层
5. 用吸管插入至第二层，小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移 至15mL玻璃离心管中，继续加入5倍体积的RPMI-1640培养液混 匀细胞。
实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/HБайду номын сангаас 1.077±0.001
单个核细胞分离
淋巴细胞分离及检测技术
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
免疫细胞的分离
——免疫细胞的分离原理及方法
免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关 的所有细胞的总称。
— Mononuclear phagocyte system
Monocyte Macrophage Dendritic Cells
—
Granulocytes
二. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯化淋巴细胞亚群）
E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术
免疫细胞分离的依据
1. 2. 3. 4. 细胞膜脆性：低渗液分离 细胞密度：密度梯度离心法 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛
离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
2、T、B淋巴细胞的分离纯化
（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）
5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。
（NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以 上为淋巴细胞，部分是单核细胞）
示ห้องสมุดไป่ตู้图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
对外周血单个核细胞分离方法探讨
对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月第1卷第9期【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。
方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer，CIK）培养。
结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。
结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。
关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cellsHanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029.【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy ethylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of plastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Resul ts The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES c entrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centr ifugation［method］ separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.Key words hetastarch ficoll monocyte外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。
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Isolation and storage of PBMC and viability test
实验原理
人 外 周 血 单 个 核 细 胞 （ peripheral blood mononuclear cell ， PBMC ）包括淋巴细胞 和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血 其他细胞不同。因此利用一种介于 1.0751.090 之 间 的 聚 蔗 糖 - 泛 影 葡 胺 （ ficollhypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布 , 从而分离出PBMC。
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上 面。 应注意保持两界面清晰，勿使血 液混入分层液内。