实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1

细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
外周血单个核细胞的 分离及活力测定
Isolation and storage of PBMC and viability test
实验原理


人 外 周 血 单 个 核 细 胞 （ peripheral blood mononuclear cell ， PBMC ）包括淋巴细胞 和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血 其他细胞不同。因此利用一种介于 1.0751.090 之 间 的 聚 蔗 糖 - 泛 影 葡 胺 （ ficollhypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布 , 从而分离出PBMC。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上 面。 应注意保持两界面清晰பைடு நூலகம்勿使血 液混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？