实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤层析法分离蛋白质
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
（3）凝胶的选择
多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200
馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，
用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
二、 实验原理
1. 常用生化实验技术
分光光度技术
电泳技术
离心技术 层析技术
2. 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
5. 加样
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露
出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量
凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子质量小组：1 班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉一、实验目的1.了解凝胶过滤层析分离生物分子及测定蛋白质相对分子质量的基本原理2.掌握凝胶过滤层析的基本操作技能二、实验原理凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术，同时也是常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
本实验采用的交联葡聚糖凝胶SephadexG—75的分级范围是3000~80000，相对分子质量在此范围内的蛋白质和其他大分子能够用这种凝胶分离开。
当蛋白质溶液加到层析柱上端并用洗脱剂进行洗脱是，相对分子质量大的蛋白质进入凝胶网孔程度小，所受阻力校，先从层析柱中被洗脱下来：相对分子质量小的蛋白质进入凝胶网孔的程度大，后被洗脱。
从样品上柱开始到某种分子被洗脱下来为止的洗脱液体积称为该分子的洗脱体积（Ve）,在层析条件完全相同的情况下，Ve与相对分子质量的对数（logM）之间存在线性关系。
在测定目标蛋白质相对分子质量之前，先测定几种已知相对分子质量的标准蛋白的洗脱体积Ve，以logM对Ve作图将得到标准曲线。
在同样的条件下测定样品蛋白的Ve，从标准曲线上即可求得相对分子质量。
三、实验步骤1.凝胶溶胀根据层析柱体积确定凝胶的用量，称取SephadexG—75干粉，加过量蒸馏水室温充分膨胀一天，或沸水浴中溶胀3h。
溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。
待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。
2.装柱与平衡将层析柱垂直固定，连接好底部流出导管，加入缓冲液排除底部空气，关闭出口。
将凝胶上面过多的溶液倾出，调节凝胶稠度在70%左右，沿玻棒往层析柱中加入凝胶基质，让其自然沉淀形成柱床，沉降后的凝胶床面应距离层析柱的顶端5cm左右，连接洗脱缓冲液、恒流泵与层析柱上端。
用2~3倍柱体积的洗脱液通过层析柱使柱床平衡，流速控制在0.5mL/min左右。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
凝胶过滤法分离蛋白质
• 3．样品处理
¾ 血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上 层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min 离心5min，弃去上清液，重复3次。最后一次吸去上清液 后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体 积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层 澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃ 暂存，一周用完)。
¾ 样品 血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合， 制成MetHb混合样品。
• 4．上样、洗脱
¾ 打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至 刚露出柱床面时即关闭出口。
¾ 吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿 管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然 后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新 露出。
¾ 加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样 品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少 量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液， 但注意切勿搅动床面凝胶，连接蠕动泵进行洗 脱。
• 5．分部收集 用自动部分收集器，以5滴/min， 5min/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待 黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后，再继续收 集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。
• 6．测定: 两种方法
– 接紫外检测仪及记录仪，绘制280nm洗脱图谱。 – 将每管收集液加入缓冲液至4ml，混匀，在425nm处测其
吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图 谱。
实 验 装 置 连接示意图
【注意事项】
1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气 泡或分层的界面时，需要重新装柱。 2．流速不可太快，否则分子小的物质来 不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下 来，达不到分离目的。
凝胶层析法分离蛋白质 HUI
1
【 目的 】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子 的实验技能
2
【 原理 】 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、 也称凝胶过滤 排阻层析, 排阻层析,是利用具有网状结构的凝胶的分 子筛作用，根据被分离物质的分子大小的不 子筛作用，根据被分离物质的分子大小的不 来进行分离的技术。 同来进行分离的技术。
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【 操作方法 】
一、凝胶的处理
Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室 干粉置于蒸馏水中室 干粉 温下溶胀3h，沸水浴加热1h， 温下溶胀 ，沸水浴加热 ，再用蒸馏水 洗涤几次， 洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾 以免在装柱后产生阻塞现象， 倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流 ）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用 洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 筛子” 胶的筛孔的大小不同。 胶的筛孔的大小不同。
4
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶层析过程示意图
5
凝胶 珠
凝胶基质
小分子 大分子
凝胶层析过程示意图
6
总结： 总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 的物质由于直径大于凝胶网孔 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动， 较短，移动速度快；所以首先流出。 较短，移动速度快；所以首先流出。 首先流出 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔， 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 的物质由于直径小于凝胶网孔 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因为流程 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中， 进入凝胶颗粒的网孔 较长，移动速率慢；所以最后流出。 较长，移动速率慢；所以最后流出。 最后流出 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透， 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 部分渗透 程度取决于它们分子的大小， 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 分子大的组分先流出 这样样品经过凝胶层析后， 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
[精品]实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
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4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠 氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。 （2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 淀出现。
1）NH4+检查
2）蛋白质检查
（二）连接层析装置
1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。
洗 脱 液 连 接 软 管 层 析 柱
连 接 软 管 收 集 容 器
（三）装柱与层析
1.装柱 向层析柱中注入少量洗 脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 （注满）。凝胶自然沉积约 1～2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
生物化学实验之－－
实验三
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。 该方法广泛用于生将烧杯中的洗脱液与层 析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般 。 为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。
3.加样与洗脱 用刻度吸管吸取 1ml 样品（蛋白质－硫酸 铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动 床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入 凝胶柱中 , 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。
凝胶层析法分离蛋白质
【实验器材】
层析柱 洗脱装置 试管等普通玻璃器皿
【实验试剂】
待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml，于 2000r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的 0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液， 重复1～2次，至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体 积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白 溶液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 (待分离样品老师已准 备好) 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液
单个凝胶珠本 身象“筛子”。不同Байду номын сангаас 型凝胶的筛孔的大小不 同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶层析过程示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶层析过程示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水浴加热，再用蒸 馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞 现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 （凝胶已处理）
二、装柱
A, 将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向 柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。
凝胶层析法分离血红蛋白 和溴酚蓝
【目的】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝 胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据蛋白的分子大小以及形状，将不同分子量的蛋白分离和纯化。
下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤，并探讨其中一些关键的因素。
1.实验准备：准备所需的层析柱、缓冲液、样品和标准品。
选择合适的层析柱是非常重要的，根据需要选择合适的分离范围和流速。
2.柱填充：将经过活化、平衡的凝胶填充到柱中。
凝胶通常是由多孔的聚合物材料制成，如琼脂糖或聚丙烯酰胺。
选择适当的凝胶类型和粒径主要根据目标蛋白的分子大小来决定。
常见的凝胶类型有Sephadex，Sephacryl和Superdex等。
3.前处理样品：前处理样品通常包括去除杂质和减少非特异性结合。
通过串联多个柱，可以实现前处理样品，如亲和柱或离子交换柱。
4.平衡柱子：使用适当的缓冲液洗涤和平衡填充的柱子，以提前去除杂质和干扰物。
5.样品加载：将待纯化的样品加载到填充好的层析柱中。
样品应根据需要进行浓缩和稀释，使其适合填充层析柱。
6.层析运行：选择恰当的流速和缓冲液来进行层析运行。
在层析过程中，缓冲液会逐渐在凝胶中通过，较大分子的蛋白会随着缓冲液流动而快速通过，而较小分子的蛋白则会受到凝胶孔径限制而在凝胶中滞留更长时间。
这样就实现了蛋白的分离和纯化。
7.收集洗脱分数：根据纯化目标的大小和形状，选择适当的分数收集。
较大分子的蛋白会在前期的分数中被洗脱，而较小分子的蛋白会在后期的分数中被洗脱。
8.分析和纯化评价：通过检测分析，如SDS-或Western blot等技术，评估样品纯度和目标蛋白的丰度。
如果需要更高的纯度，可进行进一步的步骤，如再层析或其他纯化方法。
在凝胶过滤层析纯化蛋白的过程中-选择适当的缓冲液：缓冲液的pH值和离子强度应根据目标蛋白的理化性质进行优化，以保持蛋白稳定性和纯化效果。
-选择合适的流速：流速的选择应根据柱子的尺寸和样品的需求进行调整。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
凝胶过滤法分离蛋白质.
实验三凝胶过滤法分离蛋白质【原理】在含有血红蛋白(Mw＝64 500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。
为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。
【试剂】1．抗凝全血2．四氯化碳(CCl4)3．生理盐水4．交联葡聚糖G-25(细粒)5．0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)6．0.4% K3Fe(CN)6 。
【操作步骤】1．凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。
待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。
将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。
2．装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。
加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。
然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。
床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。
3．样品处理(1) 血红蛋白溶液的制备取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。
最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。
再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。
吸取上层澄清的血红蛋白液备用。
凝胶层析法分离蛋白质
【目的】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝 胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
凝胶层析
凝胶层析是按 照蛋白质分子量大小进 行分离的技术，又称之 凝胶过滤、分子筛层析 或排阻层析。
本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品 0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝=2:1），用移液管滴加 在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流 下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上 样，再加一层洗脱液（3～5cm）。
调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速 率一致。
四、收集
用试管收集洗脱液。
五、凝胶柱的处理
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
装柱注意事项：
（1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子
（2）凝胶装柱要一次完成。
（3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。
（4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的
东西都是凝胶）。
三、加样与洗脱
先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸 取，但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样， 控制流速，使样品渗入凝胶内。
【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水浴加热，再用蒸 馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞 现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 （凝胶已处理）
实验八__凝胶过滤法分离蛋白质.
分离范围Mr（肽和球蛋白）
Sephadex G-25
1000-5000
Sephadex G –50
1500-30000
Sephadex G –75
3000-70000
凝胶过滤层析特点
设备简单，操作方便 分离条件温和，样品回收率高（100%） 实验重复性好
除盐
选择孔径小，交联度大的凝胶。
长期保存
凝胶------低浓度酸或碱溶液短期浸泡------水 反复洗涤去杂------过滤抽干------50%乙醇-----70%------90%------95%乙醇逐步脱水，
60 ~ 80 ºC烘干------装瓶保存
注意：溶胀凝胶不能直接高温烘烤
交联度越小，越难以脱水，可以将其较
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
一．目的要求：
学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。
二．原理
分子筛层析molecular-sieve chromatography
凝胶过滤层析gel-filtration chromatography 分子排阻层析molecular exclusion chromatography
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
5 4 3 2 1 0源自凝胶再生和保存 Sephadex，Sepharose-----多糖，微生物---酶--------水解糖苷键
各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌-----冰箱（冰 点以上）保存数月
防腐剂：0.02%叠氮化钠 高压蒸汽灭菌：0.1MPa，30分钟
150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。
Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水 2.5克。
葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
实验步骤
1．凝胶的处理：取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液 （本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充 分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破 碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加 热至将近1OO℃，还可以排除凝胶内部的 汽泡。
2．装柱：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓 冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左 右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上 清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次 性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶 后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加 盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实 验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱 床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是 否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
3.
上样： ①用蒸馏水溶解胰蛋白酶含量为l5mg/ml，加样 体积为0.4cm高。 ②吸去柱床上的溶液，直至胶面刚露出为止。 ③将样品沿柱壁四周缓慢加入(别搅动胶面) ④打开下流出口，使样品进入胶床。 ⑤再如上法，加１－2次小体积的洗脱液冲洗内 壁，完成后，将洗脱剂与流入口相接进行洗脱。
4．洗脱：借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为 4m1/3Omin。收集时用自动部分收集器收集，每 管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱 仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时， 还需要在分光光度计上测定OD28Onm来定）。 5．保存：样品洗脱完毕，根据层析图谱和自动部分收集器 的数据将各组分合并，保存可以冷冻，也可浓 缩。 6. 凝胶的回收：取下层析柱，将上下口打开，从上口处用 吸耳球一吹胶即可从下口流出， 凝胶可以 灭菌保存，干燥保存（乙醇乙醚脱水干 燥），和防腐剂保存。
ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２） （≥１）
议凝胶色谱法分离蛋白质
议凝胶色谱法分离蛋白质摘要：凝胶色谱法是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。
相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
具体过程包括：凝胶色谱柱的制作，凝胶色谱柱的装填，样品加入和洗脱。
要求我们谨慎操作才能成功得到移动均匀一致的蛋白质区带。
关键词：凝胶色谱法；凝胶；溶剂；凝胶色谱柱；分离度；洗脱凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。
而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。
分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
具有多孔的凝胶又称分子筛。
笔者主要从以下两方面来探讨凝胶色谱法，并结合具体的例题来解析其具体的应用。
一、凝胶色谱法的分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，可分为凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法。
凝胶过滤色谱法一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
二、凝胶色谱分离蛋白质的过程1.凝胶色谱柱的制作取长100cm，内直径2cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。
2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
凝胶柱色谱分离蛋白质
【注意事项】 1、色谱柱大小可根据实际需要选择，一般来 说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最 好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。 柱管内径太小时，会发生管壁效应，即柱管中 心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。 柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间 长，样品稀释度大，分离效果反而不好。 2、装好的色谱柱凝胶要均匀，不能有断层或 纹路或气泡，将柱管对着光照方向观察，若色 谱柱床不均匀，必须重新装柱。
4、洗脱：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液进 行洗脱。流速控制在0.25mL/min。每15分 钟收集一管，然后用紫外分光光度计于 280nm处测定每管吸光度（A280）。洗脱过 程中要注意观察蓝色区带向下移动的情况， 如前沿平齐，区带均匀，说明柱是均匀的， 可以使用。如不均一，必须重新装柱。 以管号（或洗脱体积）为横坐标，吸光度 为纵坐标作出洗脱曲线，并分辨蓝色葡聚 糖-2000和溶菌酶的洗脱峰或洗脱位置。
【实验用品】 1、材料 葡聚糖凝胶Sephadex G-100、蓝色葡聚糖2000、 溶菌酶 2、试剂 （1）蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）和溶菌酶 （6mg/mL）组成的混合液 （2）0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液 3、器具 色谱柱、铁架台、试管、紫外分光光度计或紫 外检测仪、电炉、容量瓶、烧杯、三角瓶、滴 管、移液管、玻棒。 Nhomakorabea
3、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要 有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中， 色谱柱内液面不断下降，则表示整个系统有 漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 4、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水 分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使 凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动， 导致分离效果变差，不得不重新装柱。 5、洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同， 否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从 而影响分离效果
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1×20cm层析柱、 葡聚糖凝胶Sephadex-50、 蒸馏水、 三角铁架、 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、 6mg/ml细胞色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液。
四、实验操作
1、凝胶溶胀
取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸馏水室温溶胀一 天（或沸水浴中溶胀1小时）。 待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后 再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层 清液，至无细颗粒为止。
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
1：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名 称是Sephadex 2： 聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide） 3：琼脂糖凝胶
一．目的要求：
学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与 方法。
二．原理
当不同大小的蛋白质混合 物流经凝胶层析柱时:
比凝胶网孔大的分子 不能进入珠内网状结 构，而被排阻在凝胶 珠之外，随着溶剂在 凝胶珠之间的孔隙向 下移动； 比网孔小的分子能不 同程度地自由出入凝 胶珠的内外。 大分子物质先被 洗脱出来，小分 子物质后被洗脱 出来。
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
Polyacrylamide合成凝胶，商品名Bio-Gel P， 干粉颗粒状。化学性质不活泼，极端的pH会被 水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性 质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。 P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。
琼脂糖凝胶
Agarose gel是一种大孔凝胶，主要用于像核 酸或病毒这些分子量400,000以上的物质。 颗粒软， 50度以上会融化，需低温的环境 中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱 水干燥，所以湿态中保存。 商品名Sepharose，依凝胶中干胶的百分含 量，分为Sepharose 2B，4B和6B。 经2，3 －二溴丙醇反应交联而成的凝胶为 Sepharose CL型凝胶。
接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造 成漏气、漏液 装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的 操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。 但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝 胶床高度下降。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝 胶变干。
六、思考题
实验操作
2、装柱
取1×20cm层析柱一根，底部出口套上乳胶塑料管，向层 析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处 的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关 闭下端出口。 自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm 时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。 用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水 面)。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时， 可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝 胶表面应平整
葡聚糖凝胶（Sephadex）
Sephadex不溶于溶剂，亲水性强，能 迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性 的环境中稳定。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联 度密切相关。
Superdex属于葡聚糖
Hale Waihona Puke 以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的 球形凝胶，流速快、反压低。
聚丙稀酰胺凝胶 （Polyacrylamide）
Sephadex
按交联度大小分8种型号，G值代表不同 交联度。 Sephadex G-10，15，25，50，75， 100，150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可 以吸水2.5克。
常用Sephadex分离范围
琼脂糖
三、器材与试剂
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速，使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min， 取小试管20支，每管 收集1ml，观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
Sepharose型号
型号 粒度（微米）有效分离范围（球 形蛋白质） Sepharose 2B 70000－40000000 Sepharose 4B 60000－20000000 Sepharose 6B 10000－4000000 Sepharose CL-2B 70000－40000000 Sepharose CL-4B 60000－20000000 Sepharose CL-6B 10000－4000000 Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。 型号 粒度（微米）有效分离范围（球形蛋 白质） Superose 6 5000－5000000 Superose 12 1000－300000