实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
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1×20cm层析柱、 葡聚糖凝胶Sephadex-50、 蒸馏水、 三角铁架、 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、 6mg/ml细胞色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液。
四、实验操作
1、凝胶溶胀
取Sephadex G-50 15g,加500ml蒸馏水室温溶胀一 天(或沸水浴中溶胀1小时)。 待溶胀平衡后,倾去上层清液,包括细颗粒,然后 再放些蒸馏水搅乱,静置使凝胶下沉,再倾去上层 清液,至无细颗粒为止。
实验操作
2、装柱
取1×20cm层析柱一根,底部出口套上乳胶塑料管,向层 析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处 的气泡,在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时,关 闭下端出口。 自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液,待底部凝胶沉积1-2cm 时,再打开出口,凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。 用蒸馏水过柱几遍,以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水 面)。在装柱过程中,凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时, 可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱,装柱结束后其凝 胶表面应平整
葡聚糖凝胶(Sephadex)
Sephadex不溶于溶剂,亲水性强,能 迅速在水和电解质溶液中膨胀,在碱性 的环境中稳定。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联 度密切相关。
Superdex属于葡聚糖
以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的 球形凝胶,流速快、反压低。
聚丙稀酰胺凝胶 (Polyacrylamide)
Sepharose型号
型号 粒度(微米)有效分离范围(球 形蛋白质) Sepharose 2B 70000-40000000 Sepharose 4B 60000-20000000 Sepharose 6B 10000-4000000 Sepharose CL-2B 70000-40000000 Sepharose CL-4B 60000-20000000 Sepharose CL-6B 10000-4000000 Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。 型号 粒度(微米)有效分离范围(球形蛋 白质) Superose 6 5000-5000000 Superose 12 1000-300000
实验操作
3、加样:
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合,即为上柱样品。 将出口打开,使表面的蒸馏水流出,直至恰 好与表面相平(不可使床面干掉),关紧出 口,用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口,让样品进入床内,直至样品全部 进Sephadex凝胶柱,关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
Polyacrylamide合成凝胶,商品名Bio-Gel P, 干粉颗粒状。化学性质不活泼,极端的pH会被 水解,水解后产生的COOH-具有离子交换的性 质,因此pH值应尽量控制在2-10之间。 P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。
琼脂糖凝胶
Agarose gel是一种大孔凝胶,主要用于像核 酸或病毒这些分子量400,000以上的物质。 颗粒软, 50度以上会融化,需低温的环境 中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱 水干燥,所以湿态中保存。 商品名Sepharose,依凝胶中干胶的百分含 量,分为Sepharose 2B,4B和6B。 经2,3 -二溴丙醇反应交联而成的凝胶为 Sepharose CL型凝胶。
接头不漏气,连接用的小乳胶管不要有破损,否则造 成漏气、漏液 装柱要均匀,不要过松也不要过紧,最好也在要求的 操作压下装柱,流速不宜过快,避免因此而压紧凝胶。 但也不要过慢,使柱装得太松,导致层析过程中,凝 胶床高度下降。 始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分挥发,凝 胶变干。
六、思考题
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速,使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口,让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min, 取小试管20支,每管 收集1ml,观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
一.目的要求:
学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与 方法。
二.原理
当不同大小的蛋白质混合 物流经凝胶层析柱时:
比凝胶网孔大的分子 不能进入珠内网状结 构,而被排阻在凝胶 珠之外,随着溶剂在 凝胶珠之间的孔隙向 下移动; 比网孔小的分子能不 同程度地自由出入凝 胶珠的内外。 大分子物质先被 洗脱出来,小分 子物质后被洗脱 出来。
根据实验中遇到的各种问题,总结做好 本实验的经验与教训,完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录:HPLC高压液相色谱
附录:凝胶过滤常用填料
1:葡聚糖凝胶(Polydextran),商品名 称是Sephadex 2: 聚丙稀酰胺凝胶(Polyacrylamide) 3:琼脂糖凝胶
Sephadex
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按交联度大小分8种型号,G值代表不同 交联度。 Sephadex G-10,15,25,50,75, 100,150,200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可 以吸水2.5克。
常用Sephadex分离范围
琼脂糖
三、器材与试剂