盐析法
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盐析法综述
摘要:沉淀法是利用沉淀反应,将被测组分转化为难溶物,以沉淀形式从溶液中分离出来,并转化为称量形式,最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种,盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
关键词:沉淀法;盐析;原理;方法评价;蛋白质盐析 沉淀法
沉淀法是利用沉淀反应,将被测组分转化为难溶物,以沉淀形式从溶液中分离出来,并转化为称量形式,最后称定其重量进行测定的方法。
有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化,有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少,多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂,最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒,近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法,可以用于除去杂质,也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如蛋白质、多肽、多糖、核酸等,其中以蛋白质沉淀最为常见,特别是在粗提阶段。
对沉淀形式的要求
(1)沉淀的溶解度要小,以保证被测组分能沉淀完全。
(2)沉淀要纯净,不应带入沉淀剂和其他杂质。
(3)沉淀易于过滤和洗涤,以便于操作和提高沉淀的纯度。
(4)沉淀易于转化为称量形式。
盐析法
胶体的盐析
胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低,形成沉底析出的
过程,是胶体的聚沉现象的一种
如向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或
Na2SO4]溶液后,可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中,而不影响原来蛋白质的性质。因此,盐析是一个可逆的过程。利用这个性质,可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质
盐析法的原理
盐析的原理是蛋白质在高浓度盐的溶液中,随着盐浓度的逐渐增加,由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。在盐析时,蛋白质的溶解度与溶液中离子强度关系可用下式表示:
Log S0 =β
则 Log S=β-K S×I
式中 S0 是蛋白质在纯水(离子强度 I=0)中的溶解度,S 为蛋白质在离子强度为 I 的溶液中的溶解度,K S 为盐析常数。上述公式中当温度和 pH 一定时,S0 仅取决于蛋白质的性质。因此对于同一蛋白质,在一定温度和 pH 时,S0 是一常数。
盐析常数 K S 主要取决于盐的性质(盐的离子价数和离子平均半径),也和蛋白质的性质 有关。不同的蛋白质在同一种盐溶液中的 K S 值不同,K S 值愈大,盐析效果愈好。
从上述公式可知在温度和 pH 一定的同一种盐溶液中,不同蛋白质有各自一定的β和 K S值。可以通过改变盐的离子强度来分离不同的蛋白质。这种方法称“K S分段盐析法”。
对于同一种盐溶液,如果保持离子强度不变,通过改变温度和 pH 来改变β值,也可达到盐析分离的目的。这种方法称为“β分段盐析法”。
蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目,亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中
性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同,从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
盐析法的方法学评价
盐析法简单方便,可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原浓度不高,只用于抗原的初步纯化。且盐析用盐也要求严格,盐的盐析作用要强,有较大的溶解度,必须是惰性的,来源广泛且便宜。
蛋白质的盐析
盐析法提纯蛋白质时应考虑以下几个条件的选择:盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液;第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶。
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的,需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开,将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时,就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质(如脂肪)以事先除去为宜。先除去便于以后操作。
原理:盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用,一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加。球蛋白当盐浓度不断上升时,蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出(盐析)。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时,盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响,使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时,水的活度降低,蛋白质表面的电荷大量被中和,水化膜被破坏,于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。
盐的选择:如上所述,蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离