反刍动物源枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

反刍动物源枯草芽孢杆菌的分离与鉴定青岛农业大学毕业论文题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名：学院：动物科技学院专业：动物医学班级： 1001学号：20105254指导教师：温建新2014年6月5日反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定动物医学专业袁如意指导教师温建新摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。

对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。

试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。

本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。

关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains fromRuminantsStudent majoring in veterinary medicine Yuan RuyiTutor Wen Jianxin Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin,penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification引言枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌[1]，可降低肠道内氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体内致病菌[2]，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。

同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活[3-5]。

枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，可将淀粉转化为单糖，能提高动物对饲料中营养的消化和吸收率；其还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参加机体新陈代谢，利于动物机体吸收，使动物保持健康状态；还具有降解碳水化合物的酶如纤维素酶、葡聚糖酶[6-7]。

枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥了巨大作用，并且已经得到广泛的应用。

针对鸡、猪、水产等已有大量报道，丁祥力等利用枯草芽孢杆菌WH-5净化水产养殖厂的水[10]，魏姗姗等从健康仔猪空肠黏膜分离到23 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌[11]，虽然枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物中还没有广泛应用，但近年来，枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物养殖中的研究越来越多。

本试验从健康奶牛粪便中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考，并为枯草芽孢杆菌作为反刍动物微生态制剂的研制和应用提供依据。

1 材料与方法1.1 样品来源新鲜的荷斯坦成年牛牛粪便，取自青岛某奶牛养殖场。

1.2 主要试剂MYP、LB培养基、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、细菌微量生化鉴定管、三糖铁琼脂、革兰氏染色试剂盒均购自北京陆桥技术有限责任公司。

细菌微量生化反应管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

0.5%沙黄、5%孔雀绿溶液自配。

1.3 仪器和设备SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司LED-2）、电热恒温培养箱（山东龙口市先科仪器公司YY0027-90）、XSP-2C生物显微镜。

1.4 方法1.4.1 菌株的分离纯化取菌液接种于MYP培养基平板上，置于37℃恒温培养箱培养18 h；挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落进行纯化培养，将分离纯化后得到的菌株命名为“菌K”。

1.4.2 染色镜检1.4.2.1染色采用革兰氏染色法，见文献[13]。

1.4.2.2 芽孢染色采用孔雀绿沙黄染色法，见文献[13]。

1.4.3 生化试验按照常规试验方法对菌K进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、产类淀粉化合物测定试验、柠檬酸盐试验、TSI试验、过氧化氢酶（触酶）试验、KOH试验、脲酶试验、明胶液化等试验。

1.4.4 16S rDNA的PCR扩增和序列分析将菌K接种于5 mL LB肉汤中摇菌10 h，取4mL菌液10000r/min离心2min，参考《精编分子生物学实验指南》的方法提取DNA。

在参考了国内外相关文献后[19]，由华大生物工程有限公司合成了一对芽孢杆菌属特异性引物：Primer 1：5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，Primer 2：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'，预期扩增片段长度为1436 bp。

PCR反应体系：总体系25μL ，DNA模板2μL，上下游引物各加1μL，10 ×buffer 2.5μL，dNTP2.5μL，Taq酶0.5μL，ddH2O15.5μL。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，95℃变性45s ，58℃退火50s，72℃延伸1min，72℃，10min，共32个循环，4℃保存。

PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

测序结果采用BLAST 软件和GenBank数据库中的国内外相关芽孢杆菌16S rDNA 的序列对比，用Clustal X Method 进行同源性比较。

1.4.5药敏试验按照扩散法在MYP培养基上进行药敏试验，见文献[13]。

1.4.6安全性试验选取体重为30~40 g的小白鼠10只，每组5只。

取菌液浓度约为1011cfu/mL 的LB肉汤，对空腹8 h的试验小鼠每天一次经口灌胃0.3 mL，同时设空白营养肉汤对照组。

每天观察和记录，14 d后结束试验，剖检观察内脏及组织器官变化。

2 结果2.1 形态学观察观察MYP培养基，为干燥型菌落，灰白色，无光泽，表面粗糙。

革兰氏染色阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形，染色为绿色，菌体呈红色。

芽孢图2-1 菌K菌落形态（1000×）。

图2-2革兰氏染色（1000×）。

图2-3 菌K芽孢染色（100×）。

2.2 生化试验结果菌K的生化试验结果见表2-1。

表2-1菌K生化试验结果菌K 菌K 菌K 葡萄+ 山梨醇+ 明胶液+蔗糖+ MR试验+ 触媒试+乳糖+ VP试验- KOH试-甘醇+ 淀粉水+ 脲酶试+麦芽糖+ 产类淀粉化合+ TSI试验A/A+；-蜜二- 吲哚试+木糖+ 柠檬酸-注：“+”表示阳性，“”表示阴性；TSI（三糖铁培养基）上反应情况：斜面/底面，A：产酸（黄色）；K：产碱（红色）；+：阳性；-：阴性。

产气；H2S根据《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌鉴定手册》[15]，上述结果均属于芽孢杆菌属的生化特性，证明分离菌为芽孢杆菌属。

图2-4甘醇、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验阳性，蜜二糖发酵试验阴性。

1. 接种菌K2.未接菌K对照21 21图2-5 山梨醇发酵试验阳性。

1. 接种菌K2.未接菌K对照图2-6木糖发酵试验为阳性。

1. 接种菌K2.未接菌K对照1 2图2-7 接种菌K的培养基呈红色，MR试验为阳性。

1. 接种菌K2.未接菌K对照图 2-8 枯草芽孢杆菌VP试验为阴性。

1. 接种菌K2.未接菌K对照图2-9在淀粉培养基培养的菌K菌落处滴加革兰氏碘液。

图2-10 5min后，革兰氏碘液消失，菌K淀粉水解试验为阳性。

21 21滴加碘液碘液消图2-11接种菌K 的试管戊醇层呈玫瑰红色，吲哚试验为阳性。

1. 接种菌K2.未接菌K 对照图2-13 接种菌K 的西蒙氏培养基仍为草绿色，柠檬酸盐试验为阴性。

1. 接种菌K 2.未接菌K 对照图2-14 接种菌K 的三糖铁培养基斜面和底面均为黄色，并且产气。

1. 接种菌K 2.未接菌K 对照图2-12 接种菌K 的培养液滴加碘液后为淡蓝色，产类淀粉化合物测定试验阳性。

1. 接种菌K 2.未接菌K 对照2112空白对照21 212.3 PCR 鉴定结果对菌K 进行16S rDNA 的PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500bp 左右有特异性条带（如图2-29）。

图2-17 接种菌K 的尿素酶发酵管呈浅粉红色，脲酶试验阳性。