枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定
一、目的：
掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。

将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。

二、原理：
芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。

，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

三、材料和器皿：
显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基
孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇
四、操作步骤
菌种的分离和纯化
（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。

（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。

（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。

吸取上层液0.5ml
加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取
10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种
稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。

（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆
菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2
天备用。

菌种的鉴定
1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）
（1）单个菌种的形态
（2）菌种形态的观察
2.革兰氏染色
3.芽孢染色
4.菌体大小测验
5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定
一、淀粉水解
一、原理
许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

二、培养基及试剂
培养基：肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三瓶。

0.1mpa，20min灭菌
试剂：卢哥尔氏碘液
三、步骤
将培养基融化后，冷却至50‘C左右，倒成平板，凝固后取菌种，点种于平板上，每皿点钟2点，一般于30’C培养2—4天，形成菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液，以铺满菌落为度，平板成蓝色，而菌落周围如有五色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可说明水解能力的大小。

附：培养基配方
肉汤琼脂培养基：
牛肉膏1g
蛋白胨2g
NACL 1g
琼脂 3.6g
蒸馏水200ml
葡萄糖2g
PH 7.0-7.2
121’C灭菌20min
二．过氧化氢酶测定
一、原理：
H2O2酶能催化H2O2分解成水和氧。

二、试剂：
3~10% H2O2培养基:肉汤琼脂培养基
三、操作步骤：
将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30℃ 培养1—2天。

取一干净载玻片，在上面滴一滴3~10%H2O2，挑取一环培养1—2天的菌苔在H2O2溶液中涂抹，若有气泡出现，记作H2O2酶阴性。

三.明胶水解实验
一.原理：
明胶是一种动物性蛋白质，枯草芽孢杆菌所产生的蛋白酶课分解明胶，明胶被分解后，其分子变小，虽然在低于20℃的温度下，也不再凝固。

二.操作步骤：
1.取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各试管欲接种的菌名。

2.用接种环分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

3.将接种后的试管置于20℃中培养2~5天、
4.观察明胶液化情况。

四.糖发酵试验
一.原理：
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差别，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。

发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。

当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色转变为黄色。

气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

二.培养基
培养基：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管各2支（内装有倒置的德汉氏小管）。

三.操作步骤：
1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。

2.取葡萄糖发酵培养基试管2支，接入枯草芽孢杆菌，另一只不接种，作为对照。

另取乳酸发酵培养基试管2支，同接入枯草芽孢杆菌，另一只不接种，作为对照。

3.将接过种和作为对照的4支试管均置37℃中培养24~48小时。

4.观察个试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。