谭植物体细胞杂交
植物体细胞杂交技术方法
植物体细胞杂交 技术方法
植物体细胞杂交是依据植物细胞全能性将细胞融 合技术和植物组织培养技术相结合而发展起来的一项 植物育种技术。植物体细胞杂交首先要将2种异源植物 体细胞除去细胞壁，制备出完整的有活力的原生质体 然后通过刺激使2种异源原生质体融合成具有生物活性 的杂种细胞，进而组织培养成杂种植株并进行优良性 状植株的选择与繁育。植物体细胞杂交包括一系列相 互依赖的步骤，即原生质体的制备、原生质体的融合 、杂种细胞的选择、杂种细胞的培养、由杂种愈伤组 织再生植株以及杂种或胞质杂种植株的鉴定等。
人们越来越关注健康，通过植物体细胞杂交获得的 抗病、抗虫与优良种质为减少农药使用，建立绿色优质 食品提供了广阔的发展前景。并且植物体细胞杂交育种 可以达到转基因育种的一些优良效果，而不会让人们有 对转基因食品一样的担心。植物体细胞杂交的潜力还需 要科研工作者继续开发与探索。
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我国称猴桃育种工作者在实生选育工作中也做出了 辉煌的成绩.到目前为止，从自然野生群体及实生群体中 选育出了1 000多份优良品系，近100份通过品种审定， 部分品种已被广泛应用于生产，如“秦美”、“米粮1 号”、“徐香”、“金冠”、“魁蜜”、“金魁”等.近 年来，通过实生选种选育了一批具有优良性状的称猴桃 新品种，如“红阳”、“金桃”、“豫称猴桃2号’等 。
电融合法
电融合法是在20世纪80年代初由Zimerman等创造并发展起 来一种物理融合方法。由于电融合较之化学融合有操作简便、快 速、同步性好、可以大量试验、无毒害作用等特点，己经被大量 使用。20世纪90年代国内外还同时开展了空间电融合技术的研 究，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。但是，利用电 融合需要时间确定材料的最适融合条件，更主要的是电融合需要 昂贵的设备。2005年Olivaresruster等将电融合法与PEU融合法 结合起来作为一种新的方法一电气化学法，并使用此法成功得到 柑橘的体细胞杂种，且得到再生植株。同时表明电气化学融合是 一个可靠、可重复的方法，还能促进融合细胞的分裂，提高胚胎 发生率。
植物体细胞杂交
马琴
1.植物体细胞杂交的概念
将不同种的植物体细胞，在一 定条件下融合成杂种细胞，并把杂 种细胞培育成新的植物体的技术。
请思考：
• 1.你认为两个来自不同植物的体细胞完 成融合，遇到的第一个障碍是什么？ • 2.有没有一种温和的去壁方法呢？ • 3.原生质体如何融合？融合的基础是什 么？原生质体和原生质层一样吗？ • 4.用什么方法诱导两个原生质体融合？ • 5.两个来源不同的原生质体融合后，就 是一个完整的杂种细胞吗？ • 6.如何将杂种细胞培育成杂种植株呢？
你能帮助英国公司给它起个名字吗?
番茄 马铃薯 （tomato) （potato) 番茄-马铃薯 （tomtato)
随堂练习:
下图为“番茄——马铃薯”的培育过程示意图，有关叙述正确的是 （ C ） A.获得a、b细胞需要胰蛋白酶和果胶酶 B.诱导a、b细胞融合的化学试剂一般用秋水仙素 C.a、b细胞融合为c细胞的原理是细胞膜具有流动性 D.在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的 细胞
杂种细胞
原理：植物细胞的全能性
植物组织培养
舟四号飞船进入太空后为一对“新人”——黄花烟草 原生质体和革新一号烟草原生质体举办了特殊的“婚 礼”。将两个“新人”放入融合器中，当充满液体的 融合器加上直流电场，两个原本相互游离的细胞一下 子贴到一起，开始了“窃窃私语”。紧接着，在瞬间 高压脉冲的作用下，细胞膜被击出了一个小孔，透过 这微小的空间，两股细胞质展开了“心灵沟通”。渐 渐地，细胞核也扭摆着“亲热”起来，20min后，它们 俩已是你中有我，我中有你，一个新生命就这样诞生 了。地面实验结果显示：用于融合的两个“新人”， 一个开的是粉花（标记为“一号”），一个开的是黄 花（标记为“二号”）融合后的细胞再生植株开的是 黄花，但形状却和一号相同（称“一号形状”，另一 个称“二号形状”）。这种“太空烟草”比普通烟草 个子矮，株秆粗，烟叶多，是我国太空育种试验的一 项重大成果。 “细胞婚礼”中用到的诱导融合技术是 电刺激 。
植物体细胞杂交技术的几点疑问解析
植物体细胞杂交技术的几点疑问解析展开全文植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
其过程主要包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养以及杂种植株的再生和鉴定等环节。
1植物体细胞杂交的原理植物体细胞杂交首先要使原生质体融合形成杂种细胞;其次要把杂种细胞经过植物组织培养技术培育成杂种植株。
细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。
因此，植物体细胞杂交的原理是：利用细胞膜具有一定的流动性和植物细胞的全能性进行育种。
2如何制备原生质体植物细胞外面坚硬的细胞壁是细胞融合的障碍，因此在体细胞杂交前必须除去细胞壁，获得具有活力的原生质体。
除去细胞壁早期的方法是机械法，即通过将材料置于高渗糖溶液中，使其发生质壁分离，当原生质体收缩成球状时，切开细胞壁释放出原生质体。
但由于这种方法费时、繁琐且不易获得完整的原生质体，目前已基本上被酶解法取代。
酶解法是用不同种类和浓度的酶处理植物细胞，将细胞壁解离，以获得原生质体的方法。
由于植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、果胶等，所以酶解法去壁常用的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。
正常状态下，细胞壁对原生质体具有保护和支持作用。
但在制备原生质体时将细胞壁去除后，裸露的原生质体很可能由于其内外渗透压的不同而发生吸水胀破或失水皱缩。
因此，在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性。
此外，酶液的浓度为使细胞发生轻度的质壁分离为宜1。
3如何诱导原生质体融合诱导原生质体融合的方法有化学诱导和物理诱导两种。
化学法又可分为离子诱导融合法、高钙-高pH法、PEG（聚乙二醇）法等。
离子诱导融合法常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。
由于PEG法对原生质体毒性小、易操作、成本低、不需特殊设备，融合子产生的异核率较高，且融合过程不受物种限制。
因此，该方法在植物体细胞杂交中被广泛使用。
《植物体细胞杂交技术》 讲义
《植物体细胞杂交技术》讲义一、什么是植物体细胞杂交技术在现代生物技术的领域中，植物体细胞杂交技术宛如一颗璀璨的明珠，为植物育种和品种改良开辟了全新的途径。
植物体细胞杂交技术，简单来说，就是将两个来自不同植物的体细胞，在一定的条件下融合成一个杂种细胞，然后将这个杂种细胞培育成新的植物体的技术。
这可不是简单地把两个细胞放在一起，而是涉及一系列复杂而精细的操作步骤，需要借助先进的科学手段和技术设备。
二、植物体细胞杂交技术的原理植物体细胞杂交技术的原理基于细胞膜的流动性和细胞的全能性。
细胞膜的流动性使得两个不同植物的体细胞能够相互融合，形成一个新的细胞。
而细胞的全能性则保证了融合后的杂种细胞具有发育成完整植株的潜力。
细胞全能性是指每个细胞都包含着生物体生长、发育所需的全部遗传信息，在适当的条件下，能够发育成一个完整的个体。
三、植物体细胞杂交技术的操作步骤1、原生质体的制备首先，要从植物细胞中去除细胞壁，得到原生质体。
去除细胞壁通常使用酶解法，常用的酶有纤维素酶和果胶酶。
这一步骤需要在适宜的条件下进行，以确保原生质体的活力和完整性。
2、原生质体的融合得到纯净的原生质体后，接下来就是让它们融合。
目前常用的融合方法有物理法和化学法。
物理法包括离心、振动、电激等；化学法一般使用聚乙二醇（PEG）诱导融合。
3、杂种细胞的筛选和培养融合后会形成多种类型的细胞，需要筛选出杂种细胞。
筛选的方法有很多，比如根据细胞的形态、生理特性等进行筛选。
筛选出的杂种细胞要进行培养，为其提供适宜的营养和环境条件，促使其分裂和生长。
4、杂种植物的再生和鉴定经过培养，杂种细胞会逐渐发育成愈伤组织，再分化出芽和根，最终形成完整的杂种植物体。
但这还不够，还需要对得到的杂种植物进行鉴定，确定其是否真正融合了两个亲本的遗传物质。
四、植物体细胞杂交技术的优点1、克服远缘杂交不亲和的障碍在传统的杂交育种中，亲缘关系较远的植物之间往往难以杂交成功。
而植物体细胞杂交技术可以打破这种限制，实现不同物种之间基因的交流和组合。
植物体细胞杂交
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶 液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极 化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列 成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高 频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两 个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。
专一性
融合
生物膜的 流动性
融合可能的类型？ 怎样筛选杂种细胞？ 植物体细胞杂交成功的 标志是什么？ 杂交细胞的筛选 利用杂种细胞获得杂种 植株所依据的原理？ 获得的杂种植株是否能表 杂种植株的鉴定 现出人们所期望的性状？
融合的原生质体 AB 再生细胞壁 杂种细胞AB 脱分化 愈伤组织 再分化 杂种植株 植物 细胞 具全 能性
细胞电融合芯片
在细胞电融合研究向微芯片技术领域发展过程中，微电 极间距缩小到几十微米，而电融合中细胞排队（约100～ 700 V/cm）与电穿孔（约1～8 kV/cm）所需电场条 件基本不变。根据电场强度与加载电压的关系式E=V/d （E为电场强度，V为微电极两侧施加的电压，d为微电极 间距），如果电极间距d=1 mm，则排队电压需要10～ 70 V，击穿电压则高达100～800 V。如果电极间距缩 小到d=50μm，则排队电压需要0.5～2.5 V，击穿电压 只需要5～40 V。因此，当通过微加工工艺使微电极间距 缩小后，所需电压信号就会大大降低，使细胞电融合系统 成为可用电池供电的便携式系统。由此可见，融合芯片的 研究对细胞电融合微系统整体的实现有极其重要的意义， 将是该研究的一个重要内容，也是该系统发展成微全分析 系统（micro total analysis system,μ-TAS）的基 础。
体细胞杂交步骤：
植物体细胞的杂交
复习检测
• 4、植物组织培养的条件？
细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件(适宜 的温度、湿度、光照、PH值、无菌条件）
5、植物组织培养培养基的成分有哪些？
有机营养：蔗糖、氨基酸、维生素；无机营养：水、 矿质元素：大量元素和微量元素；植物激素；琼脂
• 6、脱毒苗为什么用茎尖？
茎尖不含病毒或病毒极少
预习检测
• 1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成 融合，遇到的第一个障碍是什么？ • 2．有没有一种温和的去壁方法呢？ • 3．为什么两个原生质体能发生融合，这与 细胞膜的什么特性有关？ • 4．如果两个来源不同的原生质体发生了融 合，下一步该做何处理？ • 5．如何将杂种细胞培育成杂种植株？ • 6、植物体细胞杂交的原理是什么?
2.1植物细胞工程
植物体细胞的杂交
复习检测
• 1、什么叫全能性？ • 2、具有全能性的原因是什么？ • 3、体细胞在生物体内，全能性不能体现的原因 是什么？ • 4、植物组织培养的条件？ • 5、植物组织培养培养基的成分有哪些？ • 6、脱毒苗为什么用茎尖？
复习检测
• 1、什么叫全能性？ 具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞,都具有发 育成完整生物体的潜能,即每个细胞都具有全能性。 • 2、具有全能性的原因是什么？ 生生物体的任何一个细胞都包含有该物种所特有的全套 遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。 • 3、体细胞在生物体内，全能性不能体现的原因 是什么？ 在生物体内，在特定的时间和空间条件下， 细胞基因的选择性表达，细胞不能表现出全能 性，细胞杂交是有性生殖还是无性生殖？ • 2、杂种植株是几倍体？
植物体细胞杂交
1、定义：
将不同的植物体细胞,在一定条件下融 合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成 新的植物体的技术。
第八章 植物体细胞杂交
二 植物细胞杂交类型
（5）细胞质杂交 受体亲本的原生质体与供体亲本的细胞质
杂交，主要改变细胞质遗传，改良叶绿体和 线粒体基因组成。细胞质杂交可以缩短育种 时间。 （6）细胞核的吸收
受体亲本原生质体与供体亲本原生质体细 胞核融合，只是供体的核基因转移。
1 原生质体融合技术发展
1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体
诱导融合； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第
表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚 原生质体的融合。
缺点：异核体(heterokaryon)形成频率不 高，对细胞具有毒害作用。
一 融合方法
（2）多聚化合物法 加入一些多聚化合物如多聚鸟氨酸，改变
原生质体表面的物理特性，增强原生质体内 吞作用。 缺点：可能使细胞膜不可逆破坏。
一 融合方法
三 杂种细胞的再生植株鉴定
4 分子生物学分析 对杂种细胞进行DNA进行分析，用Southern 印记杂交法和分子标记， 另外对杂种细胞的细胞器DNA进行比较分析， 比较叶绿体和线粒体中DNA不同。
四 体细胞杂种的遗传特性
1 细胞分裂与染色体丢失 ❖ 分裂几次细胞死亡 ❖ 发育过程某一亲本的细胞核部分或全部丢失 ❖ 杂种细胞染色体数目发生变化，细胞质内含
三 杂种细胞的再生植株鉴定
1 形态学鉴定 体细胞杂交具有两个亲本的形态学性状，通 过叶片大小、颜色、花形、株高等，表面毛 状体特征进行初步鉴定。
植物体细胞杂交
植物体细胞杂交
植物体细胞杂交是在原生质体培养技术的基础上，借用动物细胞融合植物体细胞杂交的过程包括原生质体的制备，原生质体融合的诱导，杂种细胞的筛选和培养，以及杂种植株的再生与鉴定等环节。
下面以烟草和大豆的体细胞杂交为例，简要介绍植物体细胞杂交的过程。
原生质体制备选取烟草植株上的幼嫩叶片和培养好的大豆细胞，用酶解法制备原生质体。
烟草的原生质体呈绿色，大豆的无色，在显微镜下很容易将二者区别开来。
原生质体融合取等量的烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。
在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。
隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。
原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。
诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。
融合后的杂种细胞的异核体，多数情况下在第一次有丝分裂期即发生两个亲本核的融合，如果两个核在杂种细胞中位置较近，也可能在有丝分裂前就发生融合。
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电刺激
、 离心、振动
。
4、杂种细胞融合完成的标志是杂种细胞产生了新的细胞。壁
5、植物组织培养技术包括④ 脱分化和⑤ 再分化 。
6、植物细胞体细胞杂交技术的优点是克服
远缘杂交不亲和，扩大，了用于亲本组合范围
实现远源物种之间的核质组合，
从而获得新品种植株。
AA、BB、AB3种
7、诱导原生质体融合后形成的两两融合的细胞有
优势？
化学：聚乙二醇
植物细胞工程的成果和尚未解决的问题：
成果：培育出“番茄马铃薯”杂种植株
未解决问题：尚未让杂种植物按照人们的需要表现 出亲代的优良性状。
主要原因：生物基因的表达不是孤立的，他们之间 是相互调控相互影响的，所以番茄马铃薯虽具备两 个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相 互干扰。即基因间的相互作用。
不遵循，因为在生物进行有性生殖过程中，才遵循孟德尔遗传规律，而植物体细胞杂 交育种过程不属于有性生殖
（8）如果过程②用的秋a水、仙b素细处胞理都萌是发番的茄种细子胞或，幼苗那么更简单的得到番茄多倍
体植株的方法是
。
白菜—甘蓝
植物体细胞杂交过程：
植物细胞的融合
植物组织培养
植物细胞A 方法？
融合 完成
去壁
的标
志？
原生质体A
原生质体B
去壁
植物细胞B
融合的 杂种
愈
杂
原生质
人 工
体AB
诱
导
再 生 出 细
细胞
AB
脱 分
化
伤 组 织
再 分 化
种 植 株
胞
物理:离心、电刺激、 电场诱导融合
促进融合 壁 杂种细胞的种类？
的方法？ 如何检测是否成功？
D.实现原生质体的融
（D ）
3. A种植物细胞(基因型为Aa)、B种植物细胞(基因型为Bb)去掉细胞壁后，
诱导两种细胞的原生质体融合，形成单核的杂种细胞。则经过组织培养得到的 杂种植株是C(合 )[来源:学,科,网]
A．二倍体，基因型为AaBb B．二倍体，基因型为AAaaBBbb C．四倍体，基因型为AaBb D．四倍体，基因型为AAaaBBbb
（6A）.储若运运方用便传统的B.有培性植杂简交易能否得C到.成上活述率杂高种植株D？不.保能持，亲理本由优良性状 是不同种或属的细。胞之间存在生殖隔离 这项研究对于培养作物新品种方面的 重大意义在于 克服了不同生物远缘。杂交不亲和障碍，扩大了用于杂交的亲本组合范围
（7）在“番茄—马铃薯”培育过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔 遗传规律？为什么？
1.在植物细胞工程中，当原生质体融合成一个细胞后，需要诱导产生细胞壁，
参与这一过程的细胞器是 (B )
A、叶绿体、高尔基体
B、线粒体、高尔基体
C、叶绿体、线粒体
D、线粒体、内质网
2．植物体细胞杂交的目的中错误的是 A.把两个植物体的优良性状集中在杂种植株上
B.获得杂种植株 C.克服远源杂交不亲和的障碍
1．番茄为自花传粉植物，在20世纪初，科学家用植物体细胞 杂交技术，将番茄的原生质体和马铃薯的原生质体融合，成功
地培育出了番茄—马铃薯杂种植株（如图），但目前还没有实 现这美妙的设想——地上结番茄果实、地下结马铃薯块茎的植物。 据图回答下列问题：
（1）过程②叫做原生质体融技合术。与过程③密切相关的具有单层膜的细胞器 为 高尔基体。
体细胞杂交（somatic hybridization): 在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融 合以及随后将融合产物培养成杂种植株的过程。
1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草 的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞杂种。
1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得 了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种—— “Potamato”。
植物体细胞杂交的意义
有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段，主要 限于种内的品种之间。种及种以上分类单位之间繁殖植物和性不育植物中，如在马铃薯、 甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是难以通过有性杂交进 行遗传改良。 因此，建立在原生质体全能性基础上的体 细胞杂交和胞质杂交技术，对于植物的遗传改良具有重 要的意义。
三、植物体细胞杂交
探究1：结合植物细胞体细胞杂交过程图，分析讨论
完成：
（1）植物细胞融合 （原理：细胞膜的流）动性
1、两个阶段
（2）植物组织培养 （原理：细胞全能性）
2、制备原生质体的方法：利用 酶解法
的方法
（纤维素酶 和 果胶酶 等）去除细胞壁。
3、诱导原生质体融合的方法有： 聚乙二醇融合
、
（2）分别用红、绿荧光染料标记a、b细胞膜上的蛋白质，正在融合的原 生质体一半发红色荧光，一半发绿色荧光。杂种细胞上a、b两种颜色的荧 光均匀分布，这表明细胞膜具有流动性 性。
（3）在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的技术手段 是植物组织培养，依据的原理是细胞的全能，性其中过程④相当于脱分化 ，过程 ⑤（相4当）于若再利分用化此技，术其生细产胞治分疗裂烫方伤式、为割有伤丝的分药裂物。——紫草素，培养将进行 到是（5）（人填工字“母种编e子号”）与。。自然种子相比，具有的特殊优点D
种，人们所需要的是AB ，如何筛选？（生理法、
遗传法和机械法）
杂交的两个细胞
用纤维素酶、果胶酶处
植
理细胞壁
物
细
原生质体Ａ、Ｂ
胞
经离心、振 用聚二乙醇
融
动、电刺激 （ＰＥＧ）
合
诱导
融合后的原生质体
再生细胞壁
杂种细胞
（植物体细胞 融合完成的标 志）
细胞分裂 脱分化
愈伤组织
再分化
植物 组织 培养
杂种植株