鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用_李文峰

动物医学进展,2010,31(5):107-110Pr ogress in Veterinary Medicine专论与讲座鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用*李文峰1,2,麦康森1,黄倢2,史成银2*(1.中国海洋大学水产学院,山东青岛266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071)摘要:鱼类细胞培养技术作为一种重要的研究和应用技术方法,自1962年发展至今,已建立了超过220个株系。

鱼类病毒学是其应用最为广泛的领域。

论文主要就鱼类细胞的主要株系、我国鱼类细胞培养的发展以及鱼类细胞株系对于鱼类病毒的分离、鉴定、增殖及病毒病防控研究做一综述,以期对水产动物的疾病防控具有一定的指导意义。

关键词:细胞培养;病毒学;鱼类中图分类号:S941;S852.65文献标识码:B文章编号:1007-5038(2010)04-0107-04细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术,在生物领域中占有重要地位。

动物组织(细胞)培养开始于20世纪初,发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。

鱼类细胞培养晚于陆生动物,自20世纪60年代兴起,主要用于病毒学,免疫学以及生理和毒理学研究,尤其对鱼类病毒病防制具有重要意义。

1鱼类细胞培养研究现状鱼类细胞培养的系统研究和建系实践起始于1962年W olf和Quim by建立的虹鳟性腺细胞系RT G-2,随后各种鱼类细胞系相继建立,离体细胞培养在鱼类生物技术研究中的应用日趋广泛。

目前据不完全统计,世界上已经建立的鱼类细胞株系超过220株[1-13]。

其中淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞系占大部分,海水鱼类的细胞系约占30%左右。

1.1国际上已经建成的主要鱼类细胞系国内外用于研究的鱼细胞系有多种,来源的组织有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,主要包括鲤鱼(Cy p rinus catp io)上皮瘤细胞系EPC,鲫鱼(Car assius auratus)鳍细胞系CAR,金鱼巨噬细胞系GM CL,棕鮰(Pinmp halesp romehz s)性腺细胞系CCO,大菱鲆(Scop hthalmus max imus)纤维细胞T V-1、鳍条细胞系TF[2]、胚胎细胞系TEC,中华鲟(Acip enser sinensis)尾鳍细胞系[3],虹鳟(Oncorhy nchus my kiss)性腺细胞系RT G-2、前肾基质细胞TPS,褐牙鲆(Paralichthy s olivaceus)鳃细胞系FG-9307、胚胎细胞系FEC,斑马鱼胚胎细胞系ZEF、肝脏细胞系ZF-L,鲹(Car anx mate)鱼苗细胞系,大鳞大马哈鱼(Oncor hy nchus tschaw y tscha)胚胎细胞系CH SE-sp,金头鲷(Sp ar us aurata)细胞系SAF-1,太阳鱼(Lep omis macrochirus)鳃细胞系BG/G、鳍细胞系BG/F,羊鲷(Archosar gusp r obatocep halus)细胞系,银鲷(Bair diella chr y sur a)SP-1细胞系,大西洋鲑(Salmo salar)头肾细胞LSH K-1,遮目鱼(Chanos chanos)心肌细胞系及斜带石斑鱼(Ep inep helus coioides)眼睛细胞系[13]等。

鱼类细胞的培养相对比较容易,对传代培养时间的要求弹性比较大,适温范围广,使得鱼类细胞系在生物学研究领域中得到广泛应用。

1.2我国鱼类细胞系建系概况我国对于鱼类细胞培养的研究始于20世纪70年代,迄今已建立了超过40株细胞系。

张念慈、杨广智建立了草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其上皮样细胞亚株ZC-7901S1。

钱华鑫建立了鲢尾鳍细胞系等多个细胞系,并对细胞体外培养技术、保存条件以及传代细胞生物学特性进行了研究。

童裳亮建立了牙鲆鱼鳃细胞系FG、鲈鱼脾细胞系SPS、鲈鱼心细胞系SPH和真鲷鳍细胞系RSBF四株海水鱼类细胞系。

张铭等建立淡水白鲳鱼胚胎和尾鳍等4株细胞系。

Chen在2003年-2005年建立了鲈鱼多能*收稿日期:2009-09-20基金项目:中央级科研院所基本科研业务费专项资金(2007-chb-01)作者简介:李文峰(1984-),男,山东烟台人,硕士研究生,主要从事海水养殖动物分子营养与免疫学研究。

*通讯作者性胚胎细胞系LJES1,褐牙鲆胚胎细胞系FEC和大菱鲆胚胎细胞系T EC。

孟凡华等建立了鲤鱼尾鳍细胞系。

Ye H Q等建立了花鲈心脏、肝脏、脾脏和头肾细胞系[1]。

建立大菱鲆鳍细胞系T F[2]。

建立了赤点石斑鱼吻端细胞系[4]和中华鲟尾鳍细胞系[3]。

任国诚等[5]建立半滑舌鳎雄性鱼肝脏细胞系。

建立了军曹鱼脑和鳍条细胞系[6]。

总体看来,我国细胞株建立过程虽晚于国际,但是发展比较迅速;尤其海水鱼细胞系在近10年中有了长足发展,这与我国同时期大力发展海水养殖产业密切相关。

2鱼类细胞培养技术在病毒学的应用随着养殖面积和养殖密度的增大,养殖环境质量下降。

鱼类疾病尤其是病毒病暴发增多,加上相当数量的细胞株系尤其是海水鱼类细胞株系相继问世,基于细胞系的鱼类病毒学研究取得了较大的发展。

2.1现存主要鱼类病毒及危害1956年,Wolf首次利用鱼类培养细胞RTG-2分离出第一个鱼类病毒)))传染性胰坏死病毒以来,迄今见报道的鱼病毒已超过80种。

目前已经分离鉴定的鱼类病毒大约有24种,包括疱疹病毒科6种、呼肠病毒科6种、虹彩病毒科4种、副黏病毒科3种、双RNA病毒科2种、正黏病毒科1种、小RN A 病毒科1种和杯状病毒科1种。

鱼类病毒传染迅速,传染性强,且有长短不一的潜伏期,症状复杂多变,检测困难,死亡率高。

鱼淋巴囊肿病是最早发现的鱼类病毒病,其病原淋巴囊肿病毒(Ly mphocystis disease v ir us,LCDV)广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科140种以上鱼类,其感染率可高达80%,死亡率可达30%[14];传染性造血组织坏死病病毒(Infectious hem ato poiet-ic necrosisvirus,IH NV)主要感染鲑科鱼类,常造成鱼苗或幼鱼70%~90%的死亡,甚至接近100%[15];白鲟鱼虹彩病毒(White sturgeon iridov ir-us,WSIV)在不足12个月的白鲟鱼感染率可达到95%。

肿大细胞虹彩病毒病(M egalocytiv irus ir-i dovirus disease)在东亚和东南亚的真鲷、石斑鱼、大菱鲆、大黄鱼、鳜鱼等多种养殖鱼类中的频繁流行,患病鱼的死亡率从30%(成鱼阶段)到100%(幼苗阶段)不等,是危害养殖鱼类最严重的病毒病之一,给水产养殖业造成重大的经济损失[16]。

2.2应用细胞培养技术研究鱼类病毒病的优越性使用细胞培养研究鱼类病毒可以减少隐性感染机率和个体差异引起的误差,使试验结果更加准确迅速;建立细胞株(系)分离和鉴定鱼类病毒,进行生物学、病理学和流行病学研究,具有非常重要的意义。

美国水产学会推出的鱼类病毒病检测标准中细胞培养检测鱼类病毒病一直占有非常重要的地位。

在用不同方法对鱼类传染性造血器官坏死病病毒(IH NV)进行检测和比较的试验中,细胞培养检测鱼类病毒病原具有不可取代的地位。

2.3鱼类细胞系用于病毒的分离、鉴定和增殖对病毒进行分离鉴定,并通过细胞系进行病毒的扩增,以提供足够的病毒材料支持后续的深层次研究,是细胞系在病毒学方面的首要作用。

Chen S L等使用牙鲆胚胎细胞系(FEC)扩增大菱鲆红体病虹彩病毒T RBIV,感染4d后出现明显的CPE。

Qin Q W等[7]利用斜带石斑鱼的脾组织培养出细胞系GS,该细胞系对虹彩病毒和诺达病毒敏感。

Sahul H ameed A S等[17]建立了海鲈肾脏细胞系(SISK),并证明SISK对于M ABV Nc1和诺达病毒敏感。

Imajoh M等[18]建立真鲷(Pagr us maj or)尾鳍纤维原细胞系CRF-1,并证明CRF-1细胞系适合于RSIV在细胞内的增殖过程及其致病机理研究。

H uang X H等[19]建立了赤点石斑鱼脾脏细胞系(EAGS)和膘细胞系(EAGSB),并证明新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)在两株细胞系中均可产生明显CPE,但对于神经坏死病毒(NNV)以及鲤鱼春血病病毒(SVCV)均不敏感。

使用BF-2、EPC、CH SE-214、RT G-2、FH M等5种细胞系分离扩增多种虹彩病毒(FV3、BIV、PPIV、ECV、ESV、EH NV、DFV、GF6、SERV、REV282/102),证明在BF-2、EPC、CH SE-214中所有病毒均可较好的繁殖[20]。

这些细胞株可用于未知鱼类病毒的分离,同时为研究寄主和病原之间的机理提供了很有用的工具。

2.4鱼类细胞系用于病毒抑制和复制途径的阻断近几年来,在细胞水平对于病毒的抑制和清除的研究主要集中在两个方面:一方面是干扰素诱导Mx蛋白阻断途径,通过诱导M x基因表达,激活干扰素抗病毒途径,抑制鱼类病毒转录。

Wu Y C 等[21]使用BB细胞系和神经坏死病毒(NNV)证明Mx基因编码的干扰素依赖抗病毒机制存在于体外培养的细胞中,并且在病毒感染和扩增过程中对大部分细胞发挥了重要的保护作用。

Saint-Jean S R 等[22],报道用BF-2、RT G-2、CH SE-214、SAF等细胞系转染携带聚肌苷酸聚胞苷酸(po ly I:C)的质粒,以诱导激活M x蛋白基因,启动干扰素反病毒途径以抑制传染性胰腺坏死病毒(IPNV)和传染性造血坏死病毒(IH NV),结果表明,携带po ly I:C的质粒转染细胞后可以激活Mx蛋白编码,诱导干扰素抗108动物医学进展2010年第31卷第5期(总第203期)病毒途径。

在BF-2细胞中保护效率最高可达到90%以上。

Ferna c ndez-T rujillo A等[23]将M x基因转染入CH SE-214细胞系中,可有效抑制传染性胰脏坏死病毒(IPNV)在细胞中的增殖。

Gahlaw at S K等[24]报道,在大西洋鲑头肾细胞系SH K-1中,鲑鱼甲状病毒(SAV)的感染可以诱导产生干扰素的强烈表达,并进一步诱导产生Mx基因的强烈表达,从而产生抗病毒效果。

另一方面是RNA干扰途径。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的,同源m RNA高效特异性降解的现象。

Dang L T等[25]转染特异性抑制真鲷虹彩病毒(RSIV)和牙鲆棒状病毒(H IRRV)MCP蛋白的MiRNA入石鲈鳍条细胞系(GF)和牙鲆自然胚胎细胞系(H INAE),抑制了RSIV和H IRRV在宿主细胞中的表达,证明组装的病毒编码pre-M iRNA参与了RNAi相关和干扰素相关的诱导反病毒途径。