L-苯丙氨酸的生产(课堂PPT)
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
❖ 3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源，但随着 研究的深入，显现出很多弊端，如产生葡萄糖 效应和大量副产物乙酸，都会使细菌生长受到 抑制；而甘油价格低廉，容易获得，以甘油为 碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之，虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸 菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处，但 代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨 大的推动力，随着研究的深入，必然会为整个 苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。
表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物 的酶比活增减倍数
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
苯丙氨酸生物合成途径关 键基因的串联表达：
优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达
pheA:编码分支酸变 位酶和预苯酸合成 酶。简写成A
aroF:编码DHAP合成 酶。简写成F
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮
酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由 ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这 两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合 成量，进而提高DAHP的合成量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是 Phe合成途径中的关键酶之一, 受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得 到解除苯丙氨酸反馈抑制的突 变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型 aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium) 野生型aroG基因为亲本,通过 DNA suffling技术对aroG进行 改组,获得的中,在含 有Phe类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的培养基上筛选转化子,获 得4个解除Phe反馈抑制的克 隆..
3
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
L-苯丙氨酸的 应用
食品业：制成甜味剂 如阿斯巴甜；作为人 必需氨基酸制成保健 食品。
4
医药业：Phe是一些抗 癌药物甲酸溶肉痛素、 苯丙氨苄等的中间体； 将抗肿瘤药导入靶部位 的载体，或添加于复合 氨基酸输液。
化妆品业：L-Phe广泛 应用于洗发用品和护肤 用品，有滋润和美白皮 肤、亮泽，毛发的作用 。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
二、L-苯丙氨酸的生产方法
化学合成法：收率低，副产物多
酶法：工艺路线短，生产能力 强；酶的稳定性差，成本高
微生物发酵法：成本较低、产物纯 度高，对环境的污染相对较小
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
三、 L-苯 丙氨酸的 体内代谢
途径
E.coli是最常 应用的菌种。 图为以葡萄糖 作为E.coli生 长的碳源时的 由DAHP生产LPhe的详细路 径图
6
DAHP合成酶（限速反应） 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸
分支酸
分支酸变位酶（限速反应）
预苯酸
预苯酸脱水酶（限速反应）苯丙酮酸源自四、 L-苯丙氨酸代谢调控
❖ 1、增强中心代谢途径代谢流： （1）加强基因aroF的超量表达：
DAHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个 限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同 工酶。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（3）改造PTS系统 野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰
基转移系统(PTS系统)，丙酮酸激酶(pykA／ pykF编码)，PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通 过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产 量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
CK-AFPT为 pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写
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。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
3、解除反馈抑制 ❖ aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷
酸合成酶( AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键 酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制. ❖ 通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的 筛选, 获得初步解除对苯丙氨酸的反馈抑制突变 株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因 进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向 进化,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。
❖ 2、分支途径代谢调控：
在pheA、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的 基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheAtyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活， 提高L-Phe的产量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
基因克隆及基 因克隆流程图：
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
五、展望
1、苯丙氨酸生物工程菌构建的成功是令人鼓 舞的。代谢工程在物种改良方面已经展现出了 非常强的生命力. 代谢工程在苯丙氨酸菌种选 育研究中的应用，大幅提升了微生物发酵法的 苯丙氨酸生产效率，但目前仍存在一定程度的 局限性。 2、DNA 重组技术飞跃式发展为微生物合成苯 丙氨酸的代谢工程研究带来了前所未有的机遇。
ppsA：编码PEP合成 酶。简写成P
tktA：编码转酮酶。
简写成T.
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
pZE21：含有卡那霉素抗性基因的质粒；pZE12：含有氨 苄林抗性基因的质粒；pZA31：含有氯霉素抗性基因的质粒
CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的 简 写
代谢工程在L-苯丙氨酸的 生产中的应用
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Diagram 一、 L-苯丙氨酸的简介
二、 L-苯丙氨酸的生产方法 三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径
四、 L-苯丙氨酸的代谢调控
五、展望
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
一、 L-苯丙氨酸的简介
❖ L-苯丙氨酸是芳香族氨基 酸，是人体八大必需氨基 酸之一。常温下是白色结 晶或结晶性粉末固体，有 L-型、D-型两种消旋体和 DL-型外消旋体，具有生物 活性的是L-型光学异构体， 即L-苯丙氨酸(LPhenylalanine，L-Phe)。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
❖ 3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源，但随着 研究的深入，显现出很多弊端，如产生葡萄糖 效应和大量副产物乙酸，都会使细菌生长受到 抑制；而甘油价格低廉，容易获得，以甘油为 碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之，虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸 菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处，但 代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨 大的推动力，随着研究的深入，必然会为整个 苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。
表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物 的酶比活增减倍数
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
苯丙氨酸生物合成途径关 键基因的串联表达：
优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达
pheA:编码分支酸变 位酶和预苯酸合成 酶。简写成A
aroF:编码DHAP合成 酶。简写成F
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮
酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由 ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这 两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合 成量，进而提高DAHP的合成量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是 Phe合成途径中的关键酶之一, 受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得 到解除苯丙氨酸反馈抑制的突 变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型 aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium) 野生型aroG基因为亲本,通过 DNA suffling技术对aroG进行 改组,获得的中,在含 有Phe类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的培养基上筛选转化子,获 得4个解除Phe反馈抑制的克 隆..
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
L-苯丙氨酸的 应用
食品业：制成甜味剂 如阿斯巴甜；作为人 必需氨基酸制成保健 食品。
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医药业：Phe是一些抗 癌药物甲酸溶肉痛素、 苯丙氨苄等的中间体； 将抗肿瘤药导入靶部位 的载体，或添加于复合 氨基酸输液。
化妆品业：L-Phe广泛 应用于洗发用品和护肤 用品，有滋润和美白皮 肤、亮泽，毛发的作用 。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
二、L-苯丙氨酸的生产方法
化学合成法：收率低，副产物多
酶法：工艺路线短，生产能力 强；酶的稳定性差，成本高
微生物发酵法：成本较低、产物纯 度高，对环境的污染相对较小
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
三、 L-苯 丙氨酸的 体内代谢
途径
E.coli是最常 应用的菌种。 图为以葡萄糖 作为E.coli生 长的碳源时的 由DAHP生产LPhe的详细路 径图
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DAHP合成酶（限速反应） 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸
分支酸
分支酸变位酶（限速反应）
预苯酸
预苯酸脱水酶（限速反应）苯丙酮酸源自四、 L-苯丙氨酸代谢调控
❖ 1、增强中心代谢途径代谢流： （1）加强基因aroF的超量表达：
DAHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个 限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同 工酶。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（3）改造PTS系统 野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰
基转移系统(PTS系统)，丙酮酸激酶(pykA／ pykF编码)，PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通 过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产 量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
CK-AFPT为 pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
3、解除反馈抑制 ❖ aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷
酸合成酶( AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键 酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制. ❖ 通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的 筛选, 获得初步解除对苯丙氨酸的反馈抑制突变 株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因 进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向 进化,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。
❖ 2、分支途径代谢调控：
在pheA、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的 基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheAtyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活， 提高L-Phe的产量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
基因克隆及基 因克隆流程图：
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
五、展望
1、苯丙氨酸生物工程菌构建的成功是令人鼓 舞的。代谢工程在物种改良方面已经展现出了 非常强的生命力. 代谢工程在苯丙氨酸菌种选 育研究中的应用，大幅提升了微生物发酵法的 苯丙氨酸生产效率，但目前仍存在一定程度的 局限性。 2、DNA 重组技术飞跃式发展为微生物合成苯 丙氨酸的代谢工程研究带来了前所未有的机遇。
ppsA：编码PEP合成 酶。简写成P
tktA：编码转酮酶。
简写成T.
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
pZE21：含有卡那霉素抗性基因的质粒；pZE12：含有氨 苄林抗性基因的质粒；pZA31：含有氯霉素抗性基因的质粒
CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的 简 写
代谢工程在L-苯丙氨酸的 生产中的应用
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Diagram 一、 L-苯丙氨酸的简介
二、 L-苯丙氨酸的生产方法 三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径
四、 L-苯丙氨酸的代谢调控
五、展望
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
一、 L-苯丙氨酸的简介
❖ L-苯丙氨酸是芳香族氨基 酸，是人体八大必需氨基 酸之一。常温下是白色结 晶或结晶性粉末固体，有 L-型、D-型两种消旋体和 DL-型外消旋体，具有生物 活性的是L-型光学异构体， 即L-苯丙氨酸(LPhenylalanine，L-Phe)。