罗丹明123溶液(0.5mgml)
罗丹明123说明书
罗丹明123染色检测线粒体膜电位（511-535nm,稀释1000倍）外观：红棕色粉末化学名：Rh123 罗丹明123别名：Rhodamine 123; Rh123分子式：C21H17CLN2O3分子量：380.82配制：罗丹明123粉剂用甲醇配成1mg/mlde 储备液，染色时用DPBS缓冲液将其稀释为所需浓度保存：冰箱-20度避光一、检测原理：罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。
其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。
而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光，可用荧光显微镜、荧光光度计或流式细胞仪检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。
二、使用方法：1．细胞染色及分析（1）培养细胞1×106/mL重悬于培养基中；（2）加入罗丹明123染液0.1μg/mL～50 μg/mL （根椐细胞种类不同而浓度不同，一般3～10 μg/mL）；（3）37℃，5% CO2细胞培养箱孵育1～30 min（根椐细胞种类不同而不同，一般10 min）；（4）离心以培养基洗细胞两次；2．组织提取的线粒体染色及分析（1）按常规方法提取的线粒体，用适量的1×Assays Buffer（将5×Assays Buffer 用水稀释5倍）重悬；（2）常规方法进行蛋白含量测定后，用1×Assays Buffer调配成3mg/mL的线粒体溶液；（3）取2mL 1×Assays Buffer和1mL线粒体溶液；（4）加入适量待测化合物（同时设空白对照组），250C保温min；（5）加入罗丹明123染液10 μL；（6）荧光光度计检测：上述混合液全部加入石英比色皿中，置于250C下测定，激发波长488～505nm，发射波长530nm，连续记录从0 min～30 min内荧光强度的变化。
高效液相色谱法测定大鼠血浆罗丹明123的浓度
高效液相色谱法测定大鼠血浆罗丹明123的浓度唐霞;辛华雯;欧阳萌;钟建勋【摘要】目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定大鼠血浆罗丹明123(Rh123)浓度.方法血浆样品经有机溶剂乙腈萃取后,采用Hypersil BDS C18(4.6 mm×100 mm,5 μm)柱,以乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(0.02 mol·mL-1,pH值4.0)(60:40)为流动相,柱温25 ℃,流速:1 mL·min-1,于荧光FLD1A:Ex=485 nm,Em=546 nm处检测Rh123浓度.结果血浆中Rh123的线性范围为0.1~32.0 μg·L-1,最低检测限为0.1 μg·L-1.日内和日间精密度均<7%,Rh123低、中、高浓度的样品溶液提取回收率分别为87.93%,89.03%,86.11%.结论该方法专属性强、灵敏度高、重复性好,适用于实验室评价药物间相互作用.%Objective To establish a sensitive method for the determination of rhodamine 123 (Rh123) in rat plasma by high performance liquid chromatography (HPLC).Methods The plasma samples were extracted by acetonitrile,and then separated on a Hypersil BDS C18 colunm (4.6 mm×100 mm,5 μm) equipped with a guard column kept at25 ℃.The mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer (0.02 mol·L-1,pH4.0) (60:40) and was pumped at a constant rate of 1.0 mL·min-1.The peak was detected using a fluorescence detector set atFLD1A:Ex=485 nm,Em=546 nm.Results In this study,the method was validated for the Rh123 range of 0.1 t o 32.0 μg·L-1,and the lower limit of quantitation (LLO Q) was 0.1 μg·L-1.The intra-and inter-day precisions for Rh123 were less than 7%,and the mean recoveries of Rh123 were87.93%,89.03%,86.11% at low,mid,and highconcentrations,respectively.Conclusion A simple,rapid and reproducibleHPLC method was developed for the determination of Rh123 in rat plasma,which was an applicable method in modeling and description of the possible pharmacological interactions between the medicines and P-glycolprotein transporter.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2017(036)009【总页数】3页(P971-973)【关键词】P-糖蛋白;罗丹明123;药动学;相互作用,药物【作者】唐霞;辛华雯;欧阳萌;钟建勋【作者单位】四川省宜宾市第一人民医院药剂科,宜宾 644000;中国人民解放军武汉总医院临床药理科,武汉 430070;中国人民解放军武汉总医院临床药理科,武汉430070;中国人民解放军武汉总医院临床药理科,武汉 430070;中国人民解放军武汉总医院临床药理科,武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】R965;R969.2P-糖蛋白(P-glycolprotein，P-gp)是由MDR1基因编码的一种药物外排转运泵，介导药物主动泵出小肠上皮细胞，其与肝微粒体酶共同形成一道口服药物肠道吸收的屏障[1]，也是决定口服药物生物利用度的主要因素之一。
Rhodamine 123染色检测
产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品说明书
Rhodamine 123 染色试剂盒
产品组成：
产品编号 规格
Rhodamine 123 染色液
BB-4137 100 -200assays
1ml
产品简介： 贝博 Rhodamine 123 染色液可用于细胞凋亡检测，Rhodamine 123 是一种细胞通透性的、
阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性，Rhodamine 123 由于带阳 离子所以当线粒体膜电位存在的时候就会透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色 荧光，而当膜电位下降的时候，聚集的 Rhodamine 123 就减少，从而发光强度降低。Rhodamine 1arin Acetate)等组合进行多色荧光分析, 相互间无 颜色交叉; 分析细胞凋亡时, 可用 Rhodamine 123 来检测线粒体的膜电位, 而用 NAO 来检测 线粒体结构的完整性。Rhodamine 123，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细 菌。由于细胞内 ATP 的量与 Rhodamine 123 的荧光强度之间有相关性，Rhodamine 123 也可 应用于检测细胞内的 ATP。
高效液相色谱-荧光法测定大鼠血浆中罗丹明123浓度
高效液相色谱-荧光法测定大鼠血浆中罗丹明123浓度黄蓓蓓;李国锋;李青;孙亚彬;刘思佳【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2009(28)6【摘要】目的测定罗丹明123(R123) 的血药浓度.方法采用高效液相-荧光检测法,色谱柱为BTD4703 Packing C18柱,流动相为乙腈-1%三乙胺(28:72),流速1.0 mL·min-1;荧光检测器波长为485 nm(激发波长),546 nm(发射波长).结果 R123检测浓度在15.625～500.000 ng·mL-1范围内线性关系良好(r＝0.999 7),最低检测限为5.000 ng·mL-1.血浆样品的提取回收率为(83.05±2.71)%.日内与日间RSD 均＜8%.样品提取后24 h内及3次冻融稳定性良好.结论该方法操作简便,灵敏度和精确度高,重复性好,适于血浆R123浓度测定和药动学研究.【总页数】3页(P693-695)【作者】黄蓓蓓;李国锋;李青;孙亚彬;刘思佳【作者单位】南方医科大学南方医院药学部,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R977;R965【相关文献】1.高效液相色谱荧光法测定辣椒酱中的罗丹明B [J], 刘谦;白帆;刘丽丽2.高效液相色谱法测定细胞内罗丹明123的浓度 [J], 宋剑萍3.高效液相色谱法测定大鼠血浆罗丹明123的浓度 [J], 唐霞;辛华雯;欧阳萌;钟建勋4.低浓度聚氧乙烯蓖麻油对p-gp底物罗丹明123经肠黏膜透过性的影响 [J], 腊蕾;孙亚彬;李国锋5.高效液相色谱荧光法测定调味品中罗丹明B的含量 [J], 肖健;谭恩灵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞染色专题之一：台盼蓝
细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-amin o-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonic acid), tetrasodium salt3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CAS Number： 72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：>69,000(在606nm附近)染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试（dye exclusion），Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
C2007 Rhodamine 123
Rhodamine 123产品简介：Rhodamine 123也称2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester，分子式为C21H17ClN2O3，分子量为380.82，CAS Number 62669-70-9，纯度>95%。
Rhodamine 123是一种可以通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，广泛用作检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)的荧光探针，也常用于细胞凋亡检测。
Rhodamine 123可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获(sequestered by active mitochondria)，并且对细胞没有任何毒性。
Rhodamine 123的最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。
在荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光。
Rhodamine 123为红棕色粉末，溶于DMSO，也溶于乙醇，在乙醇中的溶解度可达20mg/ml。
保存条件：室温避光保存，两年有效。
溶于DMSO配制成母液后-20℃保存。
注意事项：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：可以先配制1-5mM的母液。
使用时通常使Rhodamine 123的终浓度为1-2μM即可。
详细的使用方法请参考相关文献资料。
使用本产品的文献：1. Yan C, Huang D, Zhang Y.The involvement of ROS overproduction and mitochondrial dysfunction in PBDE-47-induced apoptosis on Jurkat cells.Exp Toxicol Pathol. 2010. [Epub ahead of print].2. Gao W, Xu K, Ji L, Tang BEffect of gold nanoparticles on glutathione depletion-induced hydrogen peroxide generation andapoptosis in HL7702 cells.Toxicol Lett. 2011 Aug 10;205(1):86-95.3.Qu M, Li L, Chen C, Li M, Pei L, Chu F, Yang J, Yu Z, Wang D, Zhou Z.Protective effects of lycopene against amyloid β-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons.Neurosci Lett. 2011 Nov 21;505(3):286-90.4. Wang Y, Zhao X, Gao X, Nie X, Yang Y, Fan X.Development of fluorescence imaging-based assay for screening cardioprotective compoundsfrom medicinal plants.Anal Chim Acta. 2011 Sep 19;702(1):87-94.5. Li BY, Yuan YH, Hu JF, Zhao Q, Zhang DM, Chen NH.Protective effect of Bu-7, a flavonoid extracted from Clausena lansium, against rotenone injury inPC12 cells.Acta Pharmacol Sin. 2011 Nov;32(11):1321-6.6. Zhang WL, Zhao YL, Liu XM, Chen J, Zhang DProtective role of mitochondrial K-A TP channel and mitochondrial membrane transport pore in ratkidney ischemic postconditioning.Chin Med J (Engl). 2011 Jul;124(14):2191-5.7. Wang M, Ruan Y, Chen Q, Li S, Wang Q, Cai JCurcumin induced HepG2 cell apoptosis-associated mitochondrial membrane potential and intracellular free Ca(2+) concentration.Eur J Pharmacol. 2011 Jan 10;650(1):41-7.8. Gong K, Xie J, Yi H, Li W.CS055 (Chidamide/HBI-8000), a novel histone deacetylase inhibitor, induces G1 arrest, ROS-dependent apoptosis and differentiation in human leukaemia cells.Biochem J. 2012 May 1;443(3):735-46.9. Chen HY, Zhang X, Chen SF, Zhang YX, Liu YH, Ma LL, Wang LXThe protective effect of 17β-estradiol against hydrogen peroxide-induced apoptosis onmesenchymal stem cell. Biomed Pharmacother. 2012 Feb;66(1):57-63.。
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的.
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院陆渊指导老师郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCEC s）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。
实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。
通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。
建立一种细胞裂解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。
关键词：罗丹明123、BCECs、P-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract: The aim of this study is to figure out whether Itraconazole is an inhibitor of P-gp. To achieve this, we use brain capillary endothelial cells (BCECs) as a model and Rhodamine 123 as the substrate to evaluate the effect of Itraconzaole on P-gp. A sensitive and rapid high-performance liquid chromatography (HPLC) method with fluorometric detection after simple sample preparation procedure was developed for the determination of Rh123 in P-gp efflux studies. This method has been successfully applied to the qualification of Rhodamine123 in cell lysate obtained from P-gp efflux study conducted in brain capillary endothelial cells and can be employed for determination of the potential effect on P-gp.Keywords:Rhodamine 123, BCECs, P-gp, HPLC, Itraconazole, cell lysate前言伊曲康唑( Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小[1]。
细胞染色专题
细胞染色专题细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulf onic acid), tetrasodium salt3,3’-{*3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CAS Number：72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：>69,000(在606nm附近)染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试（dye exclusion），Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
JC-1单标法和JC-1 PI双标法荧光探针检测山羊附睾精子线粒体膜功能的研究
JC-1单标法和JC-1 PI双标法荧光探针检测山羊附睾精子线粒体膜功能的研究摘要：为准确、全面研究超低温冷冻技术对山羊附睾精子线粒体膜电位的影响效果，本试验采用荧光探针ＪＣ－１单标和ＪＣ－１／ＰＩ双标２种荧光染色方法，通过流式细胞仪和荧光显微镜两种检测手段对精子线粒体膜电位（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，MMP）变化进行检测分析，用ＪＣ－１单独染色，能准确、快速地区分高、低ＭＭＰ精子，但不能明确区分精子的存活状态，采用ＪＣ－１与碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）双标法，则能明显判定精子的存活状态。
通过对绒山羊附睾精子在冷冻前和解冻后线粒体膜电位检测，结果表明，单标记后高ＭＭＰ精子尾部呈橙红色，低ＭＭＰ精子尾部为绿色；双标后死亡精子头部呈红色（ＰＩ＋）。
对两种检测手段的比较研究，结果显示，荧光显微镜能够有效地区分出高、低ＭＭＰ及死精子，但对于活精子中ＭＭＰ的高低检测效果不理想；流式细胞仪则能够有效地区分活精子ＭＭＰ的高低，而且结果准确，速度快，敏感性高。
试验表明，两种检测方法相关性很高，分析同一处理样品时用ＪＣ＋％和ＪＣ＋／ＰＩ－％检测结果呈显著正相关（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，Ｐ＜０．０１）。
因此，对于精子线粒体ＭＭＰ的分析，采用ＪＣ－１单染与ＪＣ－１／ＰＩ双染的方法，利用流式细胞仪与荧光显微镜进行联合检测，能比较全面、准确的反映出精子线粒体的功能状态。
关键词：山羊；精子；线粒体膜电位；ＪＣ－１线粒体是活性氧形成的主要场所，活性氧的生成是导致电子传递过程的中断，氧化磷酸化与电子传递的耦合是维持高的线粒体膜电位（△ψｍ）的重要环节，而这种高的线粒体膜电位状态是细胞和精子维持活性在线粒体中产生ＡＴＰ能量所必需的保障，因此，在精子整个代谢过程所需的能量主要由线粒体提供［１，２］。
线粒体活性的改变会影响精子的能量供应［３］，且线粒体还是细胞凋亡的调控中枢［４］。
高效液相色谱法测定细胞内罗丹明123的浓度
高效液相色谱法测定细胞内罗丹明123的浓度
宋剑萍
【期刊名称】《中南大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2006(31)4
【摘要】目的:建立高效液相色谱法细胞内罗丹明123浓度的测定方法.方法:采用Zirchrom反相色谱柱(Kromasil C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温40℃,流动相为乙腈-水相(65∶35,v/v),水相为1.2mmol/L四丁基溴化铵和15 mmol/L醋酸钾,检测波长为390 nm,样品经沉淀蛋白后进样,内标为罗丹明B.结果:罗丹明123在3～300μg/L范围内线性良好,最低检测浓度为1 μg/L,日内、日间RSD均小于5%.结论:本方法专一性强、灵敏度高、简单可靠,可用于研究细胞摄取能力.
【总页数】3页(P610-612)
【作者】宋剑萍
【作者单位】湖南省肿瘤医院药剂科,长沙,410006
【正文语种】中文
【中图分类】O657.22
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张顺国
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甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响
甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响赵燕燕;孙东;刘丽艳;柳亚飞;王静【摘要】研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响,选择最佳浓度比例.建立细胞模型,选择甘草酸总浓度为1∶ 10∶ 30∶ 60∶ 120∶240μmol/L,18α-Gly与18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8 ∶ 2、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、2∶8、0∶10,根据细胞存活率,选择合适浓度比例,利用流式细胞仪测定细胞内荧光强度,寻找荧光强度最大的浓度比,即对P-gp抑制作用最强,P-gp功能最弱.研究结果表明甘草酸总浓度为1μmol/L时,随着18α-Gly比例的减少,荧光强度逐渐减弱,P-gp诱导作用逐渐增加.甘草酸总浓度为10 μmol/L和60 μmol/L时,随着两者物质的量比的变化,荧光强度变化明显;当总浓度为10 μmol/L,n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时,荧光强度较强,抑制作用明显;当总浓度为60 μmo l/L,两者物质的量比为5∶5时荧光强度最强,抑制作用最强.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】8页(P249-256)【关键词】18α-甘草酸;18β-甘草酸;P-糖蛋白功能;Caco-2细胞;不同配比/浓度【作者】赵燕燕;孙东;刘丽艳;柳亚飞;王静【作者单位】河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学药学院,河北保定 071002;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学医学实验中心,河北保定 071000;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002【正文语种】中文【中图分类】R285.5甘草是一味重要的传统中草药，甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有解毒、消炎、抗病毒、抗癌、免疫调节、降血脂等多方面药理作用[1].18位H的立体构型不同，使甘草酸存在2种差向异构体，即18α-甘草酸(18α-glycyrrhizin，18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-glycyrrhizin，18β-Gly).两者空间构型存在微小差异，但在药理学、药效学、药代动力学及不良反应等方面却有着显著不同[2].近年来，其在抗SARS病毒[3]和抗HIV病毒[4]活性方面的重要作用，使得18α-Gly和18β-Gly的比较研究越来越受到国内外研究者的关注[5-9].P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种能量依赖性蛋白，通过转运作用降低细胞内化合物浓度，减轻了药物的不良反应，同时也降低了药物对细胞的作用，使药效降低，产生耐药现象[10]；同时，P-gp的表达水平的变化，可影响药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性[11].近年来研究表明，18α-Gly和18β-Gly在细胞膜上的转运表现出一定的立体选择性，对P-gp功能和表达的影响分别表现为抑制作用和诱导作用，2种异构体的影响截然相反.目前国内外在转录水平和细胞膜转运方面对甘草酸的研究，仅限于18α-Gly和18β-Gly单体分别对CYP3A表达或P-gp 功能和表达的影响[12-13]，尚未见不同比例的18α-Gly和18β-Gly混合物在此方面的研究.上市制剂众多，大部分制剂为18α-Gly和18β-Gly混合物，二者所占比例各不相同[5]，现有各国药典及其质量标准中尚没有对2种异构体的组成比例做出规定.本实验就2种甘草酸差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响进行了研究，为新制剂的研发，临床用药选择，以及相关药物的研究与开发提供依据和新的研究思路.1.1 仪器与试剂C6流式细胞仪(美国BD公司)；ELX800酶标仪(美国宝特公司)；CKX41型倒置相差显微镜(日本奥林巴斯有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Allegar X-22R Centriguge低温高速离心机(美国BECKMAN)；MCO-18AIC恒温二氧化碳培养箱(日本三洋设备有限公司)；MLS-3780型高压灭菌锅(日本三洋设备有限公司)；WZD-160型微量振荡器(上海创发电子科技有限公司)；移液枪(美国GIBCO)；25 cm2培养瓶(美国Costar Corning)；75 cm2培养瓶(美国Costar Corning)；96孔细胞培养板(美国Corning Costar)；吸管. Caco-2细胞(30代，购自中国武汉大学典型培养物保藏中心)；胎牛血清(美国GIBCO，批号：141104)；100 U/mL青-链霉素双抗(碧云天生物技术研究所，批号：423A0522)；丙酮酸钠(美国MERCK，批号：HG3-1166-78)；Eagle’s minimum essential medium (MEM) 培养基(美国GIBCO，批号：1460618)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma-Aldrich，批号：0231)；噻唑蓝(MTT)(中国药品生物制品检定所，批号：0793)；罗丹明123(中国Solarbio，批号：1015A053)；Hepes盐(中国Solarbio，批号：710130411)；18α-Gly对照品(18α，20β-glycyrrhizic acid，ALPS制药，批号：10B001S)；18β-Gly对照品(18β，20β-glycyrrhizinic acid，ALPS制药，批号：05C11S).1.2 实验方法1.2.1 细胞培养MEM培养基制备：取1袋MEM培养基，称取HEPES 盐2.38 g和丙酮酸钠0.11 g，用800 mL去离子水溶解稀释，磁力搅拌3 h，加入Na2CO32.00 g，加入200 mL去离子水，磁力搅拌1 h，调pH为7.2～7.4，然后用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装，4 ℃保存.胰蛋白酶制备：称取胰蛋白酶0.25 g，EDTA-Na 0.30 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.04 g，葡萄糖0.1 g，苯酚红0.000 5 g，加入100 mL去离子水溶解，磁力搅拌2～3 h，调pH为7.8～8.0，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装，-20 ℃保存.冻存液制备：全培养基、胎牛血清、DMSO 3者体积比为7∶2∶1.用前配制.罗丹明123溶液配制：精确称取0.38 mg罗丹明123，用400 μL PBS溶解，备用.使用时用PBS稀释到500 μmol/L和0.550 0 μmol/L.MTT溶液制备：称取250 mg MTT，溶于50 mL PBS，磁力搅拌30 min，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装至1.5 mL EP管，4 ℃避光保存，保质期为2周.细胞培养及形态学观察：Caco-2细胞以2×105/mL接种于25 cm2的细胞培养瓶中，加入体积分数10% FBS的MEM培养基6 mL和0.1 U/L青霉素-链霉素双抗.将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养2 d，细胞换液，在第4天，细胞长到80%～90%时，用质量分数0.1%的胰蛋白酶消化并传代，当细胞生长到30～50代时用于实验.1.2.2 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞毒性的考察将处于对数生长期的Caco-2细胞以2×104/mL的密度接种于96孔培养板，每孔终体积为200 μL，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h.18β-Gly用DMSO(终体积分数<1%)溶解，18α-Gly用MEM培养基溶解，并加入等量的DMSO，用MEM培养基稀释，使甘草酸最终总浓度均为1、10、30、60、120、240 μmol/mL，两者物质的量比为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10；将每孔培养24 h后细胞培养液吸尽，于阴性对照孔加入培养基和溶剂DMSO，实验孔加入不同配比和浓度的18α-Gly和18β-Gly混合液，每孔中DMSO含量相等；空白调零孔为不含细胞的完全培养基，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养72 h.每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使结晶物溶解.以空白对照孔调零后，测量490 nm处的吸光度(A)(实验平行重复3次).计算细胞的存活率，观察各浓度细胞的存活状况.细胞存活率=(实验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值)×100%.选取细胞存活率≥90%的药物配比和浓度，进行下一步非细胞毒性实验.1.2.3 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对P-糖蛋白功能影响的考察依据“1.2.2”实验结果和文献[14-15]，选取18α-Gly 和18β-Gly总浓度为60、10、1 μmol/mL高中低3个浓度，在实验孔中分别加入以上3个浓度18α-Gly和18β-Gly不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液.将处于对数生长期的Caco-2细胞用0.1 mol/L胰酶消化，用含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，离心(4 ℃，1 500r/min，5 min)，弃上清液，用PBS分散成1×106/mL的细胞悬液，接种于2mL的EP管中.离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，按实验分组分别在实验孔加入高中低浓度的不同配比的18α-Gly和18β-Gly混合液，将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养60 min.置冰上终止作用(约10 min)，离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，用冰冷的PBS洗2次，离心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，弃上清液.按实验分组加入Rh-123或PBS，将细胞置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养60 min，置冰上终止作用(约10 min)，离心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，弃上清液，冰冷的PBS清洗2次，离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，加0.5 mL PBS轻轻吹打，制成单细胞悬液.具体分组见表1.流式细胞仪选择F1通道，每次采集1万个细胞，检测细胞内Rh-123平均荧光强度，分析时设门以除去细胞碎片和细胞团对实验的干扰.1.2.4 统计学处理数据用±s表示，组间显著性差异用t检验，P<0.05差异具有统计学意义.2.1 细胞培养及形态学观察细胞传代于25 cm2培养瓶中，很快开始贴壁，48 h换液，再经48 h细胞贴壁80%～90%.在倒置相差显微镜下观察，Caco-2细胞成铺路石状镶嵌排列，形态正常，与文献报道[16]相似，见图1.2.2 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞毒性的考察实验分别考察了18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞的毒性.结果表明，甘草酸总浓度一定时，18α-Gly和18β-Gly比例不同对细胞存活率影响不同.在7种不同配比的条件下，甘草酸总浓度在1～60 μmol/L，细胞存活率均大于90%，为非细胞毒性浓度.其中当甘草酸总浓度在1～30 μmol/L，n(18α-Gly)：n(18β-Gly)=8∶2时，以及总浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时，细胞总体存活率表现较高(>110%)，见图2 a、b、c、d；总浓度在120～240 μmol/L内，18α-Gly和18β-Gly在7种不同配比的条件下，细胞存活率均小于90%，为细胞毒性浓度.随着浓度增加，毒性表现增强，见图2 e、f.因此选取甘草酸总浓度分别为1、10、60 μmol/L，18α-Gly和18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10进行下一步研究.2.3 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对P-gp功能影响的考察实验分别考察了18α-Gly与18β-Gly总浓度(1、10、60 μmol/L)及不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)混合液对Caco-2细胞内P-gp 转运Rh-123的影响，见表2.结果表明，18α-Gly单体浓度为10 μmol/L和60μmol/L时，细胞内Rh-123摄取量增多，与阴性对照相比荧光强度增强，对P-gp功能表现出抑制作用；18β-Gly单体浓度为1、10、60 μmo l/L时，细胞内Rh-123摄取量减少，与阴性对照相比荧光强度减弱，对P-gp功能表现出诱导作用，见图3.甘草酸总浓度为1 μmol/L时，随着18α-Gly与18β-Gly 2种异构体比例的减小，荧光强度逐渐减弱，诱导作用逐渐增强；在浓度为10 μmol/L，二者物质的量比为4∶6时，以及浓度为60 μmol/L，物质的量比为5∶5时，荧光较强，抑制作用明显，见图3.甘草酸由于C18位H构型不同，存在2种立体异构体，18α-Gly为反式构型，18β-Gly为顺式构型，根据位阻效应，前者大于后者，易于受体蛋白结合，导致两者比例不同时，甘草酸的药效不同.甘草酸2个差向异构体虽然在自然界、制剂中或在体内很难发生差向异构化，但在一定的化学条件下能发生构型的改变.本实验前期工作中已经研究了不同的炮制条件对甘草药材中主成分异构体的含量及比例的影响[17]，结果表明，生甘草中18α-Gly与18β-Gly的物质的量比始终为1∶7，未发现炮制条件的变化，对甘草酸2个差向异构体比例的影响.并对国内外上市的4代甘草酸制剂中主成分18α-甘草酸和18β-甘草酸进行了含量测定[5]，对同一代制剂不同剂型、不同代制剂同一剂型中两差向异构体的组成比例进行了分析.结果表明，甘草酸制剂不同，18α-Gly与18β-Gly所占比例各不相同，第1代与第2代、第3代与第4代甘草酸不同剂型制剂中，18α-Gly与18β-Gly的物质的量比分别为1∶20～1∶109、3∶1～500∶1.甘草酸上市制剂众多，各制剂选用的原料药不同以及采取的制剂工艺不同，都可能会导致甘草酸制剂中主成分差向异构体组成比例的不同.从天然产物中提取、精制18β-Gly比较简单，成本比较低，而直接合成18α-Gly成本高，多数厂家选用由前者转化的方式制造18α-Gly.目前市售的甘草酸制剂的主成分均以18α-Gly与18β-Gly混合物的形式存在，以α体占主体的第4代甘草酸制剂-异甘草酸镁，也含有少量的18β-Gly (n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=500∶1[5]).所以研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响，对新制剂的研发和临床用药选择具有重要的意义.P-gp可以将细胞内的药物泵出细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，减轻细胞的毒副作用，保护机体免受外源毒素作用，这也是导致肿瘤细胞出现耐药性的重要原因.Caco-2细胞来源于人类结肠癌及直肠癌，P-gp是其中的一种主要转运蛋白.Rh-123是P-gp的特异性底物，可以用来评价P-gp的功能活性，当P-gp功能受抑制时，Rh-123从Caco-2细胞的外排量将减少.18β-Gly甘草可以通过诱导P-gp功能以加速药物排出细胞外，起到解毒的作用，而18α-Gly对于P-gp的抑制作用，则可以减弱细胞外排，使药物在细胞内发挥最大药效.诱导和抑制作用，对于其他治疗药物的辅助作用非常大，可以使药物发挥最大药效同时，对机体的毒性降到最低，因此寻找合适的浓度比例非常重要.本实验首先培养Caco-2细胞模型，配制甘草酸总浓度为1、10、30、60、120、240 μmol/L 6个浓度系列，18α-Gly与18β-Gly比例分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，通过毒性实验，选择了1，30，60 μmol/L作为低中高3个浓度系列，用流式细胞仪测定细胞内Rh-123荧光强度，判断P-gp的功能活性，从而推断甘草酸合适的浓度比，最终得出在总浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5时，荧光最强，细胞的外排作用最弱，细胞内药物最多，抗药性最弱.实验结果表明，甘草酸的作用强度及安全性与18α-Gly和18β-Gly的浓度和比例有关.通过甘草酸总浓度(1、10、60 μmol/L)及不同配比物质的量比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液对Caco-2细胞内P-gp转运Rh-123作用影响的比较研究，在浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5时，荧光强度最强，对Caco-2细胞内P-gp抑制作用最强，对于药物外排最弱，可减弱抗药性，可能是18α-GL和18β-Gly发挥最大协同作用的的最佳浓度配比.具体作用机制尚需进一步研究.【相关文献】[1] ABE M，AKBAR F，HASEBE A，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis[J].J Gastroenterol，2003，38(10)：962-967.[2 ] 宋红波，刘茜，赵辉，等.甘草酸铵类制剂中甘草酸差向异构体的分析[J].药物分析杂志，2012，32(5)：883-886.SONG Hongbo，LIU Qian，ZHAO Hui，et al.Analysis of 2 epimers in ammonium glycyrrhizinate drugs[J].China J Pharm Anal，2012，32(5)：883-886.[3] CINML J，MORGENSTEM B，BAUER G，et al.Glycyrrhizin，all active component of liquorice roots，and replication of SARS-associated coronavirus[J].Lancet，2003，361(9374)：2045-2046 DOI：10.1016/S0140-6736(03)13615-X.[4] PLIASUNOVA OA，HONA，KISELEVA I，et al.The anti-HIV activity of glycyrrhizic acid penta-O-nicotinate[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2004(11)：42-46.[5] 赵燕燕，石敏健，刘丽艳，等.4代甘草酸制剂主成分异构体及杂质含量差异分析与变化趋势[J].药物分析杂志，2014，34(2)：247-254.ZHAO Yanyan，SHI Minjian，LIU Liyan，et al.Analysis of content differences 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碧云天线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123)说明书
线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123)产品简介：碧云天的线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Rhodamine 123)是一种以Rhodamine 123为荧光探针对线粒体进行染色并进行膜电位检测的试剂盒。
本试剂盒可用于活细胞线粒体膜电位的检测，也用于细胞凋亡的检测。
本试剂盒可使用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测设备进行检测。
Rhodamine 123也称2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester ，中文名为罗丹明123，分子式为C 21H 17ClN 2O 3，分子量为380.82，CAS 号为62669-70-9。
Rhodamine 123是一种通透细胞膜的黄绿色阳离子荧光探针，最大激发光波长为507nm ，最大发射光波长为529nm 。
Rhodamine 123的化学结构式和激发、发射光谱图参考图1。
图1. Rhodamine 123的化学结构式和激发、发射光谱图。
本试剂盒检测线粒体膜电位的原理如下。
在正常细胞中，Rhodamine 123能够依赖线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, ΔΨm)选择性进入线粒体基质，可发出明亮的黄绿色荧光；当细胞发生凋亡或坏死时，线粒体膜电位丢失，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)持续开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm )的崩溃，Rhodamine 123从线粒体中释放出来，从而导致线粒体内黄绿色荧光强度的明显降低。
此外有报道，在个别特定情况下，Rhodamine 123探针在线粒体内过度聚集后可能会出现自发淬灭(self-quenching)现象，线粒体内黄绿色荧光强度降低，而在凋亡发生时，线粒体中黄绿色荧光增强。
银杏叶提取物对氯吡格雷人体内药动学影响
银杏叶提取物对氯吡格雷人体内药动学影响汪冬吟;黄秋玲;陈丽凤;陈志民【摘要】目的探讨银杏叶提取物对氯吡格雷人体内药动学影响及其相关机制.方法选取14名健康男性志愿者,第一阶段服用氯吡格雷150 mg/d(单用药组);第二阶段进洗脱期后,受试者连续服用银杏叶提取物240 mg/d,连续14 d,第14天给予银杏叶提取物1 h后,再空腹服用氯吡格雷(联用药组).两组均在给药后采集受试者0～24 h外周静脉血,检测氯吡格雷代谢产物SR-26334的浓度.此外,建立体外Caco-2细胞模型,以罗丹明-123和维拉帕米分别为阴性和阳性对照,采用流式细胞技术检测银杏叶提取物和氯吡格雷对Caco-2细胞内的荧光强度的影响.结果联合用药组受试者血中SR26334的AUC(0-t)(3192.3±45.035)[(mg·h)/L]、AUC(0-∞)(3343.017±43.829)[(mg·h)/L]和Cmax(340.988±11.257)[(mg·h)/L]均高于单独用药组,CL/F(0.071±0.007)低于单独用药组(P<0.05).Caco-2细胞内荧光强度,银杏叶提取物组(487±14.12)和联合用药组(497±17.22)高于阴性对照组(P<0.05).结论银杏叶提取物能显著提高氯吡格雷羧酸在人体内的生物利用度和吸收总量,其作用机制可能与银杏叶对P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用有关.【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2018(029)012【总页数】5页(P1133-1137)【关键词】银杏叶提取物;氯吡格雷;SR-26334;药动学【作者】汪冬吟;黄秋玲;陈丽凤;陈志民【作者单位】362000 泉州,解放军第180医院药剂科;362000 泉州,解放军第180医院药剂科;362000 泉州,解放军第180医院药剂科;362000 泉州,解放军第180医院药剂科【正文语种】中文【中图分类】R364.17银杏叶主要含黄酮类、酚酸类等化合物，其药理作用为抗氧化、清除自由基、增加血流量及神经保护等[1-3]。
高中细胞染色专题
细胞染色专题zz细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfo nic acid), tetrasodium salt3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CAS Number：72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：>69,000(在606nm附近)染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试（dye exclusion），Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
口腔上皮细胞的显微镜观察
特性
嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色 体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究
Ethidium bromide(EB)518/605 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳
红色荧光
分析,染色体观察
DAPI 358/461 蓝色荧光
Hoechst33342 350/461 蓝色荧 光
罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用 它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有 负电荷，而罗丹明123具有正电荷，二者电性相吸。 所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发 射特性为507nm和529nm。
三、仪器、材料与试剂
仪器 荧光显微镜，倒置显微镜
材料 A549、WI-38 pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸
实验六 细胞核和线粒体的荧光观察
一、实验目的
学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 33342 与细 胞成分的结合特性和光谱特性
二、实验原理
1.荧光显微镜
常用荧光探针介绍
细胞参量
荧光探针 吸收/发射 nm
DNA和RNA Propidum iodide(PI)
实验步骤
将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上, 至细胞进 入对数生长期
配制Ho.33342和罗丹明123 工作液: Ho.33342 (10μg/mL), 罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4）
将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次， 分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L， 室温暗处孵育10min
蛋白和抗体的 FITC 494/518 绿色荧光 耦联探针
Texas red 595/615 红色荧光
罗丹明检测说明书
商品名称：罗丹明B检测试剂盒
规格： 40次/盒
检测项目：用于食品中含罗丹明B的定性，筛选
产品简介：
罗丹明B俗称玫瑰红，是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料。
曾经用作食品添加剂和调味品（主要是辣椒粉和辣椒油）染色剂。
使用了被污染的调味品制作食品时会造成残留。
实验证明罗丹明B会致癌，现在已不允许用作食品染色。
本检测方法可快速简便的判定疑似样品，用于食品中含罗丹明B的定性，筛选。
检测下限： 1mg/kg
技术参数：
检测步骤：
1.固体样品：称取0.5g样品于提取瓶中，摇动1～2分钟，然后将提取瓶直立放置2分钟使其分层。
2.液体样品：用吸管吸取1mL样品于提取瓶中，摇动1～2分钟，然后将提取瓶直立放置2分钟使其分层。
3. 吸取1mL上层液体过滤于5mL离心管中，然后再向此离心管中加入1mL净化剂，摇动离心管1～2分钟，将离心管直立放置5分钟，待其分层后观察下层液体。
4.当离心管中下层液体显橙色或者红色时，表明样品中含有玫瑰红B，下层液体显黄色或无色时表明样品中不含玫瑰红B。
在样品操作时建议做阴性对照试验试剂盒组成：
罗丹明B检测试剂 1瓶（棕色玻璃瓶）
层析柱 40支
小吸管 40个
样品杯 40个
1.5毫升离心管 40个
小勺 1个
品牌：天迈生物
产地：杭州。
流式细胞仪检测线粒体膜电位方法的研究
流式细胞仪检测线粒体膜电位方法的研究岳磊;张垚;张楠曦【摘要】This paper aimed to determine the applicable conditions for detecting mitochondri -al membrane potential (Δψm ) of fluorescent dyes by flow cytometry .Rhodamine 123, Di-OC6 (3) , TMRE, JC-1 were chose and used to analyze the conditions of each dye for the mitochondria membrane potential detection through the induction of UV .The results showed that the change of Δψm detected by Rhodamine 123 was larger than other dyes , which may be related to the adaption of Rhodamine 123 to acute cell damage .By comparing the experi-mental method , it is more accurate for the future of the mitochondrial membrane potential de-tection by flow cytometry .%通过流式细胞仪进行检测，研究选择每种检测线粒体膜电位（Δψm）荧光染料的适用条件。
选用罗丹明123、DiOC6（3）、TMRE、JC－14种荧光染料，通过对紫外线诱导后细胞的线粒体膜电位进行检测，分析每种染料的检测条件。
结果表明，罗丹明123检测到的Δψm 变化较大，这可能与罗丹明123适用于检测细胞急性损伤中线粒体膜电位变化相关。
细胞染色专题之一：台盼蓝
细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-amin o-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonic acid), tetrasodium salt3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CAS Number： 72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：>69,000(在606nm附近)染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试（dye exclusion），Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。
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注意事项：
1、 对于 6 孔板中的样品，本试剂共可以检测 100 个样品；对于 12 孔中的样品，本试剂 共可以检测 200 个样品。 2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相关：
编号 CC0022 DC0032
名称 D-Hanks 平衡盐溶液(1×,含酚红) Masson 三色染色液
北京雷根生物技术有限公司
罗丹明 123 溶液(0.5mg/ml)
简介：
Rhodamine 123 是一种可以通过细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，呈黄 绿色荧光，多用于检测线粒体膜电位，也常用于细胞凋亡检测。它可以快速通过细胞膜， 仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获，并且对细胞没有任何毒性。Rhodamine 123 还用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌，由于细胞内 ATP 的量与 Rh123 的荧光强度之间有相关性，因此 Rh123 也被用于检测细胞内的 ATP。
组成：
编号 名称 Rhodamine 123(0.5mg/ml) 使用说明书
CT0047 Storage
100μl 4℃ 避光 1份
操作步骤(仅供参考)：
1、取对数生长期的细胞，将细胞密度调整到 3×105 个/ml 接种至 6 孔板，培养 24h，同 时应设立阴性对照。 2、 在各细胞中加入所需干预措施，继续培养一定时间后，收集细胞，PBS 清洗 2 次。 3、 PBS 重悬细胞与 EP 管中，加入 Rhodamine 123(0.5mg/ml)，37℃避光孵育。 4、 流式细胞仪(激发波长 511nm，发射波长 534nm)或荧光显微镜下检测。