实时定量PCR技术原理

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实时荧光定量PCR技术

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。

PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。

实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。

反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。

2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。

PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。

循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。

3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。

4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。

5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。

比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。

实时qPCR具有广泛的应用。

1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。

2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。

3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。

4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. Ct 值的定义-- Ct值。

C代表Cycle，t代表（如图1所示）。

2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct越多，Ct贝数的对数，纵坐标代Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。

而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2）SYBR 荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方PCR来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。

但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。

但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。

例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。

在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。

它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。

本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。

实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。

其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。

实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。

引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。

引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。

2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。

标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。

这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。

通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。

3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。

此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。

4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。

实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。

通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。

实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。

实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测转基因食品检测基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control）通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣除背景荧光后的相对荧光量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。

实时定量PCR技术(real-time PCR)

样品重复

重复次数请遵循统计学的要求小样本统计，n>6（n>3）未知样品和标准品都要重复所有复管在同样条件下完成PCR

2.2 技术方法及数据

绝对定量与相对定量

绝对定量：绝对标准曲线法

标准品拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。

TaqMan探针

TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。

PCR效率对定量结果的影响

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

real-time rt-pcr的原理

real-time rt-pcr的原理
实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）的原理基于实时荧光定量PCR技术，结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个技术。

首先，通过逆转录将RNA转录成cDNA。

这个过程由逆转录酶和引物完成，
引物与目标RNA序列的特异性序列互补。

当引物与目标RNA序列结合时，逆转录酶开始参与反应，通过循环变化的温度条件，使RNA序列转录成互补的DNA（cDNA）。

然后，这个cDNA作为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系中含有荧光探针和
引物，引物与cDNA的特异性序列互补。

当引物与cDNA序列结合时，通过循环变化的温度条件，使DNA片段扩增。

在PCR扩增过程中，荧光信号发生器被激活，荧光信号开始释放。

荧光信号的释放与DNA片段的扩增相关联，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA片段的扩增情况。

通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定初始样品中目标RNA的量。

总之，实时反转录聚合酶链式反应是一种高灵敏度、高特异性的RNA检测技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和基因突变研究等领域。

实时定量荧光pcr原理

实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。

其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。

实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。

在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。

当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。

而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。

根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。

为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。

首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。

根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。

最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。

实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。

它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。

相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。

实时荧光定量PCR技术的两种方法原理简述

实时荧光定量PCR技术的两种方法原理简述依据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。

现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶的3'5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分别，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成wan全同步。

而新型TaqMan—MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的shou选技术平台2. SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的加添与PCR 产物的加添wan全同步。

SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是：① 开始反应，当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光；② DNA变性时，SYBR染料释放出来，荧光急剧削减；③ 在聚合延长过程中，引物退火并形成PCR引物；④ 聚合完成后，SYBR染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实时荧光定量PCR技术依据化学原理可以分为探针类和非探针类。

探针类实时荧光定量 PCR 技术紧要是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的加添；非探针类实时荧光定量 PCR 技术紧要通过荧光染料来指示产物的加添。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

缺点
实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA
相对定量中的内标
• 内标通常是β -actin、GAPDH基因等看家基因. • 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小. • 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量.
,是对未知样品
的绝对量(拷贝数)进行测定的方法; 应用于病毒病原菌定量检测,转基因拷贝数分析等
相对定量,并不是测定基因的绝对量,而是分别测定目的基因和参比基因的量,再求出对于参比基因的目的基因的相对量,最后再进行样品间相对量的比较应用于mRNA表达量解析.
实时荧光定量技术的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧
光信号累积实时监测整个PCR进程，最后
通过标准曲线对未知模板进行定量分析的
方法
实时荧光定量PCR 原理----------实时原理
常规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一
PCR的反应的三个主要步骤
变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 复性是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端。延伸在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长及另一股的合成。
• 合成的原料及水。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
绝对定量
绝对定量的方法相对简单.
未知浓度的样品与标准品同时进行反应，将扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到未知样品的绝对量。

实时定量pcr原理

实时定量pcr原理实时定量PCR原理。

实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测和量化DNA或RNA的技术，它结合了传统PCR技术和荧光探针技术，能够实现对靶基因的快速、准确和高灵敏度的定量分析。

实时定量PCR的原理基于传统PCR技术，但是在PCR反应过程中通过荧光信号实时监测靶基因的扩增情况，从而实现对靶基因的定量分析。

在实时定量PCR中，常用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。

在实时定量PCR反应中，首先是DNA或RNA的反转录和前PCR扩增，然后在PCR反应过程中，荧光信号与靶基因的扩增量成正比。

通过检测荧光信号的增加，可以实时监测靶基因的扩增情况，并且可以根据荧光信号的增加来计算出靶基因的起始量。

实时定量PCR的优势在于其快速、准确和高灵敏度的特点。

相比于传统PCR技术，实时定量PCR无需等待PCR反应结束后再进行结果分析，而是可以在PCR反应过程中实时监测靶基因的扩增情况，从而能够更快速地得到定量分析结果。

同时，实时定量PCR的荧光信号检测系统能够实现对靶基因的高灵敏度检测，能够检测到极低浓度的靶基因。

另外，实时定量PCR还具有高度的准确性。

通过荧光信号的实时监测，可以避免了传统PCR技术中可能出现的内源性荧光干扰，从而能够更准确地进行靶基因的定量分析。

总的来说，实时定量PCR技术是一种快速、准确和高灵敏度的DNA或RNA定量分析技术，它在基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域具有广泛的应用前景。

随着实时定量PCR技术的不断发展和完善，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。

实时定量PCR技术原理

实时定量PCR技术原理实时定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于DNA扩增的技术，可以在PCR过程中同时进行扩增和定量分析。

其原理是利用DNA聚合酶酶的催化作用，在初始模板DNA的基础上，通过PCR循环反应不断扩增目标序列的数量，并通过荧光信号的强度变化来实时监测扩增过程。

实时定量PCR使用双链DNA作为模板，首先通过热变性步骤将DNA模板的两条链分离。

然后，在降温的过程中，引物与模板特异性结合形成引物-模板复合物。

引物是针对目标序列设计的短链DNA，根据目标序列的首尾碱基序列确定。

在PCR扩增的第一次循环中，引物与模板复合物在热稳定的DNA聚合酶的存在下，通过链延伸反应合成新的DNA链。

DNA聚合酶酶会催化引物与模板的配对延伸反应，合成新的DNA链，同样的，新合成的DNA链会作为模板在下一循环中被再次复制，形成指数级的扩增。

实时定量PCR技术使用DNA荧光染料或探针来标记并检测扩增过程中产生的DNA数量。

荧光信号可以分为非特异性荧光信号和特异性荧光信号。

非特异性荧光信号来自于引物和其他反应物的副产物，在扩增早期出现，但由于无法用于准确定量，一般在分析中会被排除。

特异性荧光信号来自于目标序列的扩增产物，并通过荧光探针或广泛用的双链DNA染料（如SYBR Green）进行检测。

通过在每一个循环反应中实时监测荧光信号的强度，可以获得一个荧光强度随循环次数而变化的荧光曲线。

荧光强度的增加代表了目标序列的扩增量，通过与已知浓度的标准样品对比，可以计算出初始样品中目标序列的数量。

实时定量PCR技术的优势在于实时监测扩增过程，能够准确、快速地定量目标序列的数量，并且操作简便，适用于许多领域，如基因表达分析、病原微生物检测、基因突变检测等。

acrip-qpcr原理

acrip-qpcr原理一、概述acrip-qpcr是一种先进的分子生物学检测技术，它结合了实时定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）和基因芯片的优点，实现了对特定基因表达的快速、准确和大规模检测。

二、工作原理1. 实时定量PCR技术实时定量PCR技术是一种用于测定基因表达量的技术，通过PCR 技术扩增特异性核酸序列，并在每一个PCR循环后进行实时检测，从而获得靶基因的拷贝数，进而确定其在样本中的表达水平。

传统的RT-PCR方法虽然可以检测特定基因的表达，但其灵敏度、特异性和通量等方面存在局限性。

而acrip-qpcr则通过实时定量PCR技术，结合高灵敏度、高特异性探针和全自动高通量芯片检测，实现了对特定基因表达的精确、快速和大规模检测。

2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种将大量探针分子固定于支持物上的技术，用于检测样品中大量基因的表达情况。

通过将样品中的基因序列与探针分子杂交，从而获得样品中基因表达的信息。

传统的基因芯片方法虽然可以同时检测多个样本中的基因表达情况，但其操作复杂、成本高昂、检测范围有限。

而acrip-qpcr则通过将实时定量PCR技术和基因芯片技术有机结合，实现了对特定基因表达的高效、准确和大规模检测。

1. 高灵敏度：acrip-qpcr能够检测到低至单个拷贝的靶基因，具有更高的灵敏度。

2. 高特异性：通过设计特异性的探针，acrip-qpcr能够有效地区分靶基因和其他相似序列，具有更高的特异性。

3. 高通量：acrip-qpcr能够同时检测大量样本中的特定基因表达情况，具有更高的通量。

4. 自动化：acrip-qpcr采用全自动高通量芯片检测，操作简便、快速，减少了人为误差。

5. 可扩展性：acrip-qpcr能够适应不同样本类型和实验需求，具有可扩展性。

四、应用领域acrip-qpcr技术广泛应用于基础生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。

在基础生物学研究中，acrip-qpcr可用于研究特定基因在细胞类型和不同发育阶段中的表达模式，鉴定新的生物标志物，以及研究基因调控网络等。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtim

实时荧光定量PCR技术的原理及应用
(Real time Quantitative PCR)
分子生物学技术平台
江燕琼
精选ppt课件
1
提纲：
实时荧光定量PCR原理
数学原理
化学原理
实时荧光定量PCR的方法应用
绝对定量
相对定量
定量PCR的实验要素
平台定量PCR仪器介绍
精选ppt课件
2
实时荧光定量PCR定义：
药物疗效考核
耐药性研究
精选ppt课件
22
绝对定量与相对定量的定义
精选ppt课件
23
绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
标准样品的种类：
•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒
•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA
•PCR的产物
精选ppt课件
对照样品内参基因浓度
精选ppt课件
29
定量PCR的实验要素
精选ppt课件
30
样品
●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之
间
●DNA用量：0.05 ng –100 ng
●RNA纯度：OD260/OD280=2.0
●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA
取1 uL
TaqMan法优缺点
精选ppt课件
20
Real-time PCR 方法应用
精选ppt课件
21
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测
转基因食品检测
基因表达研究
•相对定量(Relative Quantification，RQ)

实时定量RTPCR的原理及方法

实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。

该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。

本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。

二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。

这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。

实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。

反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。

这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。

然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。

在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。

实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。

这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。

实时定量pcr原理

实时定量pcr原理
实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一种用于检测和测量特定DNA序列量的技术。

该技术结合了传统PCR和DNA定量技术，可以在PCR反应进行过程中实时监测和记录DNA的增殖情况。

实时定量PCR的原理是通过特定引物和荧光探针结合，实时监测和记录PCR反应中DNA的增量。

该技术通常采用荧光染料或探针，如SYBR Green或探针涉及双校验报告器染料。

SYBR Green可以结合PCR产物中的双链DNA，生成荧光信号，而探针方法则利用探针与PCR产物的高度特异性结合，产生荧光信号。

这些信号可以由实时定量PCR仪器进行检测和记录。

在实时定量PCR中，反应体系包含待测DNA样本、引物、荧光信号探针（如SYBR Green）或特异性探针以及其他反应组分。

PCR反应进行过程中，随着DNA的增殖，荧光信号也会相应地增加。

实时定量PCR仪器可以对荧光信号进行连续的检测和记录，通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值），可以确定初始模板DNA的量。

实时定量PCR的原理基于实时检测和记录PCR反应中DNA 的增量，无需进行后续凝胶电泳或测序等步骤，从而实现了高效、准确和革新的DNA定量。

由于其高灵敏性、快速性和定量性，实时定量PCR在生物医学研究、遗传学分析、疾病诊断和药物筛选等领域得到广泛应用。